低濃度含油泥砂生物修復試驗研究

楊 勇 ，肖成磊 ，郭 兵 ，楊 庭 ，王永林 ，王新新 ，白 鶴

（1.天津大學化工學院，天津 300072； 2.中海油能源發(fā)展股份有限公司安全環(huán)保分公司，天津 300457；3.中海石油環(huán)保服務（天津）有限公司，天津 300457）

0 引言

含油污泥是由水油、水油乳狀液和懸浮固體組成的一種復雜的復合物，包含各種烷烴、芳香烴、NSO化合物等，屬于危險固體廢物[1-2]，直接排放會嚴重破壞生態(tài)環(huán)境[3]。含油污泥從來源上看，可分為原油開采、油田集輸過程及煉油廠污水處理產(chǎn)生的含油污泥[4-5]。含油污泥組成各異，通常含油率在10%~50%之間，含水率在40%~90%之間[6-9]。含油污泥含有大量老化原油蠟質(zhì)、瀝青質(zhì)、膠體、固體懸浮物、細菌、鹽類、酸性氣體、腐蝕產(chǎn)物等，還包括生產(chǎn)過程中投加的大量絮凝劑、緩蝕劑、阻垢劑、殺菌劑等水處理劑[10-11]。若不能有效處理，會對生態(tài)環(huán)境造成嚴重破壞。由于含油污泥黏度高、脫水難，處理起來相當困難，給油田企業(yè)廢物處置帶來了沉重的負擔。

現(xiàn)有含油污泥的處理方式包括物理處理、化學處理和生物處理（生物修復）等[12－13]。相對于物理處理和化學處理，生物處理因具有成本低、效率高，不會造成土壤二次污染等特點而得到廣泛應用[14-17]。富集后的降解菌可利用本土強化技術對污泥進行生物降解[18-19]?，F(xiàn)有的研究一方面僅限于考察不同種類微生物去除石油烴污染物的機制，而未考察所培育的微生物的現(xiàn)場應用效果，因而難于在油泥砂修復過程獲得應用；同時，現(xiàn)有的研究規(guī)模大都停留實驗室模擬階段，尚未見油泥砂修復的現(xiàn)場示范應用或大規(guī)模應用。因此，筆者根據(jù)油泥砂的特點，研究了現(xiàn)場應用修復作用，對改善和恢復生態(tài)環(huán)境質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

蛋白胨、大豆蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司）；磷酸氫二鉀、氯化鈉、瓊脂粉（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸（天津市光復科技發(fā)展有限公司）；草酸銨結晶、碘-碘化鉀、冰乙酸、氯化鈉、乙酸鈉（天津市北方天醫(yī)化學試劑廠）；無水乙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設備

PCR 儀（powercycle，德國耶拿分析儀器股份公司）；生化培養(yǎng)箱（LRH-150，上海一恒科學儀器有限公司）；高速離心機（H1650-W，湘儀動力測試儀器有限公司）；電子天平（ME204，梅特勒-托利多集團）；超凈臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）；顯微鏡（E200，株式會社尼康）；紫外分光光度計（UV-1200，上海美普達儀器有限公司）；搖床（HNY-211B，天津市歐諾儀器儀表有限公司）； 立式壓力蒸汽滅菌器（MLS-3750，上海一恒科學儀器有限公司）；旋渦混合儀（XW-80A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；恒溫冰箱（BCD-539WL，青島海爾股份有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

BH（1 L）：NH4NO31 g；NaCl 1 g；KH2PO41 g；K2HPO41 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl20.02 g；FeCl3（或 FeSO4）0.05 g，（pH 值 =7.2）。

石油降解培養(yǎng)基： 向BH 培養(yǎng)基中加入1%的原油，即100 mL BH 培養(yǎng)液中加1 g 原油。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選與馴化

采集礦井周圍有明顯溢油的石油污染土壤，采樣點6 處，采集土樣約100 g，用封口袋封裝留存；以石油為單一碳源，250 mL 搖瓶在 30 ℃，220 r/min 馴化培養(yǎng)石油污染處采集樣品；馴化約1 周后，棄上清液加經(jīng)高溫滅菌的加1%原油的BH 培養(yǎng)基100 mL，繼續(xù)在 30 ℃，220 r/min 下 250 mL 搖瓶培養(yǎng)；重復2~3 次；取轉接后經(jīng)降解的菌液1 mL 于1.5 mL移液管中，以十倍稀釋法稀釋成10-5，10-6，10-7，10-8，10-9 待用； 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基放入水浴中加熱至融化，待冷卻至50 ℃左右，倒平板（每個皿約15 mL)，平置，待凝固；將經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用移液器吸取0.1 mL 菌液對應接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個編號設3 個重復）；平板劃線法得單一菌落；恒溫培養(yǎng)，并觀察菌株形態(tài)，留圖保存，每菌預存斜面及甘油管各2 支。

1.2.2 降解率的估測

取250 mL 錐形瓶，稱取原油重量為1 g。重復操作約 50 次。配置 BH 培養(yǎng)液約 5 L，分裝 100 mL 于 250 mL 錐形瓶，得到含油質(zhì)量分數(shù)1%的油瓶；取對數(shù)期單菌母液3 mL，9 000 轉離心5 min，倒掉上清液，洗滌2~3 次后，用 3 mL 雙蒸水懸浮，接種 1 mL 至 50 mL 石油降解培養(yǎng)基，做3 個平行；將搖瓶在37 ℃，220 r/min轉速下培養(yǎng)菌株7 d，待油瓶適度降解后，停止培養(yǎng)并取樣測試；用正己烷萃取菌株降油后的培養(yǎng)液，留上層清液，放置待揮發(fā)后測定殘余油的質(zhì)量（m，單位g）。降解率的估算：菌株的降解率 = （1-m）/1。

1.2.3 氣質(zhì)分析（GC-MS）

選用正己烷，將萃取液做適當稀釋，稀釋倍數(shù)為1 000 倍的體積比，將1 μL 樣品注入進樣口進行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。氣質(zhì)方法：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（Agilent 6890），HP-5MS 毛細管柱（最大承受溫度：325 ℃，行程長度：30.0 m，標稱內(nèi)徑：250.0 μm，標準膜厚度：0.25 μm，初始流速：1.0 mL/min，額定初始壓力：52.61 kPa，平均流速：36 cm/s），利用氮氣作為載氣，載氣的流速是35.0 mL/min。初始柱溫設置為50 ℃，保持0.5 min后以10 ℃/min 的速度加溫到310 ℃。

1.2.4 油泥砂生物修復無害化處理小試

綜合應用單因素實驗法和響應面實驗法，確定優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件和磁絮凝條件。將菌體懸液分別與硅藻土、鋸末、秸稈、花生殼和活性炭等5 種吸附材料按1 ∶10 的比例混合均勻，放置10 d 后，稀釋平板涂布法進行菌落計數(shù)，考察吸附材料對石油烴降解菌的吸附能力。采用生物修復方法，物料組成見表1。

表1 油泥砂生物修復物料比例

按表1 的比例將洗脫后的油泥砂與秸稈、有機肥、石油烴降解菌劑進行充分混合、堆制，調(diào)節(jié)含水量至30%。定時取樣分析，監(jiān)測其含油量等參數(shù)變化。為了進一步檢驗生物修復后的殘渣的殘留毒性，開展植物試驗。選取生長快速，易于栽培且環(huán)境友好的黑麥草和苜蓿作為實驗對象[20]，分別用處理前的含油泥砂、生物修復后的含油泥砂和健康土壤種植黑麥草和苜蓿2 種植物，觀察記錄植物生長狀況。

1.2.5 油泥砂生物修復無害化處理中試

建立150 m3油泥砂生物修復示范工程，該工程建立3 個生物堆，每堆50 m3油泥砂。為了獲得理想的處理效果，建立堆肥大棚，控制堆肥過程的溫度和釋放的VOC。測定含油量等參數(shù)。DGGE 用于分析自然環(huán)境中微生物群落變化。實驗過程中樣品采用MOBIO 公司的土壤基因組試劑盒PowerSoilRDNA Isolation Kit 進行基因組DNA 的提取，先用瓊脂糖凝膠電泳檢測，之后進行PCR 擴增，引物采用富含GC夾子的 338F 與 518R，酶使用 TransFastRTaq DNA Polymerase，放于4 ℃保存?zhèn)溆?。分別配置體積比為0%和80%的變性母液儲存，調(diào)配相應梯度濃度的凝膠，確定合適的變性劑范圍為30%~60%。灌膠，而后放入40 ℃烘箱中約30 min。150 V 電壓下，電泳7 h后取出膠塊，EB 染色30 min，使用Tanon-1600 凝膠成像儀進行成像分析，使用Tanon Gis 軟件對DGGE圖譜進行凝膠圖譜分析。

2 結果與討論

2.1 石油烴降解菌分析結果

石油降解菌分析結果見表2。

表2 石油降解菌分析結果

2.2 油泥砂生物修復無害化小試、中試處理結果

2.2.1 含油量、重金屬等指標測定

油泥砂生物修復無害化小試處理后，含油烴含量顯著降低，見圖1。經(jīng)過12 個月的生物修復，含油質(zhì)量比降至3 000 mg/kg 以下，經(jīng)過24 個月的生物修復，含油質(zhì)量比降至2 000 mg/kg 以下。對含水率、pH值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標進行匯總，見表3。通過分析上述指標發(fā)現(xiàn)：油泥砂生物修復后滿足GB/T 23485—2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標準。

圖1 油泥砂生物修復無害化處理含油量變化小試

油泥砂生物修復無害化中試處理后，含油量顯著降低，見圖2。經(jīng)過130 d 的生物修復，含油質(zhì)量比降至 3 000 mg/kg 以下，對含水率、pH 值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標進行匯總，見表3。通過分析上述指標發(fā)現(xiàn)： 油泥砂生物修復后滿足GB/T 23485—2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標準。

圖2 油泥砂生物修復無害化處理的含油量變化中試

表3 油泥砂生物修復后各指標測試結果

2.2.2 植物試驗結果

黑麥草和苜蓿在處理前的含油泥砂上不能生長，但是在生物修復后的含油泥砂上生長旺盛。盡管部分指標與健康土壤有一定差距，但是生物修復后的含油泥砂中的黑麥草的根長和莖長這2 項指標明顯高于健康土壤，苜蓿的莖重和根長這2 項指標明顯高于健康土壤。這說明生物修復后的含油泥砂毒性已大大降低，適合植物生長。油泥砂生物修復后植物生長情況見表4。

表4 油泥砂生物修復后植物生長情況

2.2.3 微生物群落變化

油泥砂生物修復無害化后的微生物群落變化、條帶回收二次DGGE 電泳圖譜、菌落PCR 的結果見圖3。從測序結果可以看出，菌落的種類主要集中在Alcanivorax，Pseudomonas，Marinobacter3 個屬，這 3 個屬的微生物均對石油烴有較好的降解效果，是土壤和水體等環(huán)境中關鍵的石油降解菌。油泥砂生物修復過程中出現(xiàn)了這些菌，說明修復過程中出現(xiàn)了大量的石油降解菌，進一步印證了油泥砂的生物降解。

圖3 微生物群落變化、條帶回收二次DGGE 電泳圖譜和菌落PCR 結果

2.2.4 滲濾液分析

生物處理后油泥砂的最終處理有填埋和作為綠植土2 種方式。目前，填埋是主要的處理方式。滲濾液是目前影響填埋的關鍵因素，為探討填埋的可行性，對生物處理后油泥砂的滲濾液進行分析。對生物處理后油泥砂進行取樣，按USEPA Method 5030 進行前處理, 根據(jù) US EPA Method 8260C 用 GC/MS 儀分析, 根據(jù)NIST 譜庫對檢測出的主要化合物進行定性檢索，并以內(nèi)標1,4-Dichlorobenzene-d4 為參考物進行半定量。堆肥滲濾液GC/MS 分析圖譜見圖4。

圖4 堆肥滲濾液GC/MS 分析圖譜

分析并未發(fā)現(xiàn)支鏈烷烴、直鏈烷烴、多環(huán)芳烴等油泥砂中的典型組分，從側面印證了生物處理降解了油泥砂中的石油烴。堆肥滲濾液中僅發(fā)現(xiàn)了低濃度的二氯甲烷、三氯甲烷、溴二氯甲烷等物質(zhì)。油泥砂生物處理后的滲濾液中二氯甲烷質(zhì)量濃度僅為6.7 μg/L，遠遠低于日本滲濾液排放控制標準規(guī)定二氯甲烷的0.2 mg/L，滿足該項的規(guī)定。

3 結論

從含油泥砂中分離篩選2 株石油烴降解菌，研究菌株對含油泥砂的降解能力及生物修復效果。

（1）綜合應用單因素實驗法和響應面實驗法，確定優(yōu)化了菌株W25 和W33 的發(fā)酵條件和磁絮凝條件。實驗室小試結果表明：油泥砂生物修復無害化處理后，含油量顯著降低。經(jīng)過12 個月的生物修復，含油質(zhì)量比降至3 000 mg/kg 以下，經(jīng)過24 個月的生物修復，含油質(zhì)量比降至2 000 mg/kg 以下，含水率、pH值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標均達到GB/T 23485—2009 《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標準要求。

（2）通過植物試驗檢驗生物修復后殘渣的殘留毒性。分別對生物修復前、生物修復后的含油泥砂和健康土壤種植黑麥草和苜蓿2 種植物，觀察記錄植物生長狀況，結果表明：生物修復后的含油泥砂毒性已大大降低，適合植物生長。

（3）為進一步推進油泥沙生物修復的工程化應用，建立了150 m3油泥砂生物修復示范工程，經(jīng)過130 d 的生物修復，含油質(zhì)量比降至3 000 mg/kg 以下，含水率、pH 值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標均達到GB/T 23485—2009 《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標準要求，在修復過程中出現(xiàn)了大量的石油降解菌，進一步印證了含油泥砂的生物降解。對生物處理后油泥砂的滲濾液分析表明：滲濾液中二氯甲烷質(zhì)量濃度僅為6.7 μg/L，遠遠低于日本滲濾液排放控制標準規(guī)定二氯甲烷0.2 mg/L，滿足該項的規(guī)定。