8 周不同時(shí)間點(diǎn)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的影響

姜俐洋，史昱，黃傳，蘇悅，萬(wàn)春曉

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，天津300052；2.天津市海河醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，天津300350）

腦卒中是全球第二大死亡原因和長(zhǎng)期殘疾的首要原因，具有很大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。在美國(guó)，每年大約有795 000 人患腦卒中或復(fù)發(fā)性卒中，其中40%的人導(dǎo)致終身殘疾[1]。腦卒中后的有氧運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，提高患者的日常生活活動(dòng)能力[2]。但腦卒中后的早期康復(fù)介入時(shí)間點(diǎn)仍然存在爭(zhēng)議。Li 等[3]發(fā)現(xiàn)卒中后6 h 開(kāi)始運(yùn)動(dòng)會(huì)加劇細(xì)胞凋亡，而24 h 后運(yùn)動(dòng)并不會(huì)導(dǎo)致這種現(xiàn)象。相反，Humm 等[4]發(fā)現(xiàn)卒中后24 h 開(kāi)始運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致皮質(zhì)組織進(jìn)一步損傷。其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠卒中后7 d開(kāi)始運(yùn)動(dòng)會(huì)加劇大鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)內(nèi)前肢區(qū)域的損傷[5]。此外，早期運(yùn)動(dòng)中，只有輕度至中度運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)卒中后大鼠恢復(fù)，而劇烈運(yùn)動(dòng)并不能改善卒中后功能[6]。這些研究共同強(qiáng)調(diào)了卒中后運(yùn)動(dòng)開(kāi)始時(shí)間對(duì)損傷和身體殘疾康復(fù)的重要性。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）參與調(diào)節(jié)缺血卒中后的一系列分子過(guò)程，如神經(jīng)血管的重塑和修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)發(fā)生等，使組織適應(yīng)卒中后的狀態(tài)[7]。但早期不同時(shí)間介入的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否可以調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用，目前少有研究證明。磁共振擴(kuò)散張量成像（diffusion tensor image, DTI） 是磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的特殊形式，而各向異性分?jǐn)?shù)（fractional anisotropy，F(xiàn)A）是DTI 的衍生參數(shù)，其量化了腦白質(zhì)中水?dāng)U散的方向性程度，是局部微結(jié)構(gòu)完整性的替代度量[8]。在單側(cè)大腦半球病變的疾病中，大多數(shù)研究都集中于患側(cè)FA/對(duì)側(cè)FA 的比值，即相對(duì)FA（relative FA，rFA）在預(yù)測(cè)神經(jīng)恢復(fù)和運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的作用[9]。本研究通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行腦卒中后1 d、1 周開(kāi)始運(yùn)動(dòng)干預(yù)及靜息干預(yù)，觀察8 周干預(yù)對(duì)大鼠腦組織VEGF 蛋白表達(dá)、FA 值和神經(jīng)功能評(píng)分的影響，探究腦卒中后不同時(shí)間點(diǎn)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)神經(jīng)功能的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取SPF 級(jí)雄性8~9 周Spra gue-Dawley（SD）大鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK 京2014-0004）24 只，體重280~310 g。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM 組）、靜息組（SED 組）、術(shù)后1 d 開(kāi)始運(yùn)動(dòng)組（EX-1D 組）、術(shù)后1 周開(kāi)始運(yùn)動(dòng)組（EX-1W 組），每組6 只。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig 1 Experimental flow chart

1.2 大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral ischemia occlusion, MCAO）再灌注模型制備 采用改良Longa線栓法制備左側(cè)MCAO 模型[10]。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（300 mg/kg 體重）腹腔注射麻醉后，鈍性分離和結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，向頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓（型號(hào)：2838-A4 北京西濃科技有限公司），深度1.8~2.0 cm。60 min 后取出線栓，建立MCAO 模型，手術(shù)總時(shí)長(zhǎng)＜90 min，保持大鼠肛溫（37±0.5）℃。假手術(shù)組暴露動(dòng)脈，但不插入線栓，其余損傷同上。24 h 進(jìn)行Longa 評(píng)分，1~3 分者納入本實(shí)驗(yàn)[10]。

1.3 跑臺(tái)訓(xùn)練及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 運(yùn)動(dòng)組大鼠分別于造模后1 d 或1 周開(kāi)始進(jìn)行8 周運(yùn)動(dòng)，使用ZS-PT 小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司），角度0°，速度12 m/min，30 min/d。大鼠停留至跑臺(tái)末端時(shí)用軟毛刷刺激促使繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，直至完成干預(yù)（圖1）。

所有動(dòng)物入組前均行3 d 的行為學(xué)評(píng)分預(yù)適應(yīng)和跑臺(tái)預(yù)適應(yīng)，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度同前。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）預(yù)適應(yīng)期間不能配合完成跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。（2）造模后死亡。（3）造模24 h 后Longa 分不滿足要求。

1.4 改良神經(jīng)功能評(píng)分（modified neurological severity score, mNSS）測(cè)定 如前所述，采用mNSS 評(píng)分，分值為0~18 分，分值越大神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重[11]。由同一實(shí)驗(yàn)人員分別于造模后1 周及干預(yù)8 周后進(jìn)行評(píng)定。

1.5 FA 值的測(cè)定 造模后1 周及干預(yù)8 周后對(duì)各組進(jìn)行DTI 和T2WI 掃描（SIEMENS MagnetomVerio 3.0T MR）。大鼠麻醉后仰臥位固定。T2-SPACE 序列，層厚=0.4 mm，掃描層數(shù)72 層，TR=1 000 ms，TE=155 ms，采集次數(shù)2 次，F(xiàn)A=120°，F(xiàn)OV=60 mm×60 mm，矩陣=192×192；同一實(shí)驗(yàn)人員在MRI 工作站采集和處理數(shù)據(jù)。根據(jù)大鼠腦圖譜選取同一層面（Bregma-1.08～-4.20 mm）患側(cè)受累內(nèi)囊區(qū)域以及健側(cè)對(duì)應(yīng)等面積區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)測(cè)量FA 值，rFA=患側(cè)FA/健側(cè)FA。

1.6 VEGF 蛋白印跡檢測(cè) 提取距離腦梗區(qū)3～4 mm的圍梗死區(qū)腦組織總蛋白，采用BCA 試劑盒定量蛋白濃度。以β-Actin 作為等量蛋白質(zhì)上樣對(duì)照，取60 μg 蛋白/泳道進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分離總蛋白，隨后100 V 恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入VEGF（1:1 000，Abcam, UK）、內(nèi)參β-Actin 抗體（1:1 000，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA），4°C 孵 育 過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:2 000，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）室溫孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光法通過(guò)凝膠電泳成像儀顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0 和Graphpad Prism6.0 處理，本研究中定量資料經(jīng)Shapiro-Wilks檢驗(yàn)后，數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)性，以(±s 表示。組間比較用方差分析，各組之間兩兩比較用LSD方法。各組VEGF 與mNSS、rFA值采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠造模后1 周及干預(yù)結(jié)束后mNSS 評(píng)分的比較 在造模后1 周以及干預(yù)8 周后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行mNSS 評(píng)分。組內(nèi)比較，SED 組、EX-1D 組、EX-1W 組在8 周干預(yù)結(jié)束時(shí)的mNSS 評(píng)分均明顯降低（均P＜0.001）。各組組間比較中，在造模后1 周時(shí)，EX-1D 組大鼠mNSS 評(píng)分（8.17±1.169）分別明顯低于SED 組（9.67±0.817，P=0.023）、EX-1W 組（9.33±1.211，P=0.039）。干預(yù)8 周后，與SED 組（4.67±0.817）相比，EX-1D 組大鼠mNSS 評(píng)分明顯降低（2.67±0.817，P=0.002），而EX-1W 組沒(méi)有出現(xiàn)顯著變化（3.83±1.169，P=0.149）；與EX-1D 組比較，EX-1W 組大鼠mNSS 評(píng)分明顯升高（P=0.049，圖2）。

圖2 各組大鼠造模后1 周及各組分別干預(yù)8 周后mNSS 評(píng)分變化Fig 2 Variance in mNSS scores after one week of modeling and after 8 weeks of intervention in each group

2.2 各組大鼠造模后1 周及干預(yù)結(jié)束后rFA 值的比較 組內(nèi)比較，各組與造模后1 周相比，SED 組、EX-1D 組、EX-1W 組干預(yù)8 周后的rFA 值均明顯升高（均P＜0.001）。組間比較，在造模后1 周，EX-1D 組大鼠的rFA 值（0.37±0.039）較SED 組（0.30±0.656）明顯升高（P=0.049），而EX-1W 組與SED 組無(wú)明顯變化（P=0.408）。干預(yù)8 周后，與SED 組（0.48±0.090）相比，EX-1D 組（0.72±0.071）、EX-1W 組（0.62±0.076）大鼠rFA 值均顯著提高（均P＜0.001），且EX-1D 組rFA 值明顯高于EX-1W 組（P=0.005，圖3）。

圖3 各組大鼠造模后1 周及干預(yù)8 周后rFA 值變化Fig 3 Variance in rFA values after one week of modeling and 8 weeks after intervention in each group

2.3 各組大鼠干預(yù)結(jié)束后腦組織VEGF 蛋白表達(dá)的比較 干預(yù)8 周后，與SHAM 組（0.82±0.191）相比，SED 組大鼠VEGF 蛋白表達(dá)量（0.45±0.160）明顯降低（P=0.019），EX-1D 組（1.19±0.376）蛋白表達(dá)顯著升高（P=0.017），而EX-1W 組（0.91±0.206）蛋白未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.543）。與SED 組相比，EX-1D 組、EX-1W 組VEGF 蛋白表達(dá)量均明顯升高（PEX-1D=0.000，PEX-1W=0.005）。EX-1D 組的VEGF 表達(dá)略高于EX-1W 組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.060，圖4）。

圖4 干預(yù)8 周后各組大鼠腦組織VEGF 蛋白表達(dá)Fig 4 VEGF protein expression in brain tissue of rats in each group after 8 weeks of intervention

2.4 各組大鼠VEGF 與mNESS、rFA 值的相關(guān)性分析 干預(yù)8 周后，將VEGF 蛋白表達(dá)與mNSS 評(píng)分、rFA 值進(jìn)行相關(guān)性分析。在EX-1D 組、EX-1W 組中，VEGF 的增加與mNSS 評(píng)分的增加呈負(fù)相關(guān)（r=-0.816，PEX-1D=0.048；r=-0.829，PEX-1W=0.041）。在SED 組、EX-1D 組、EX-1W 組中，VEGF 的增加與rFA 值的增加呈正相關(guān)（r=0.872，PSED=0.024；r=0.831，PEX-1D=0.04；r=0.857，PEX-1W=0.029）。在EX-1W組中，rFA 值與mNSS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.854，P=0.03）（圖5）。

圖5 各組大鼠VEGF 與mNESS、rFA 值的相關(guān)性分析Fig 5 Correlation analysis of VEGF with mNESS and rFAin rats of each group

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)支持卒中后的體育鍛煉可以通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)可塑性來(lái)改善神經(jīng)功能。美國(guó)心臟協(xié)會(huì)已經(jīng)將有氧運(yùn)動(dòng)作為卒中康復(fù)中的基本組成部分[12]。由于醫(yī)療系統(tǒng)的巨大負(fù)擔(dān)，大量研究重點(diǎn)關(guān)注卒中后的運(yùn)動(dòng)康復(fù)方案策略，通過(guò)減少卒中后認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)損傷促進(jìn)患者恢復(fù)[13]。但對(duì)卒中后運(yùn)動(dòng)開(kāi)始時(shí)間仍然有待深入研究，且多項(xiàng)相互矛盾的結(jié)果更突出了卒中后運(yùn)動(dòng)開(kāi)始時(shí)間的重要性[3,12]。本研究通過(guò)對(duì)大鼠卒中后1 d、1 周開(kāi)始運(yùn)動(dòng)組研究發(fā)現(xiàn)：與SED 組比較，造模后1 周時(shí)EX-1D 組mNSS 評(píng)分明顯降低，rFA 明顯升高（P=0.049），而EX-1W 組mNSS 和rFA 值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組分別8 周干預(yù)后，EX-1D 組比EX-1W 組大鼠的mNSS 評(píng)分明顯降低（P=0.049），rFA 值明顯增高（P=0.005），EX-1D組的VEGF 表達(dá)略高于EX-1W 組，但尚未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.060）。VEGF 表達(dá)水平與mNSS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，而與rFA 值呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，腦梗死后的運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)效果優(yōu)于SED 干預(yù)，且EX-1D 組的干預(yù)效果更佳。這可能是由于運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了卒中后腦組織的VEGF 表達(dá)，改善大鼠的FA 值，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

FA 值是MRI 的一個(gè)參數(shù)，其變化可以反映幾種生物學(xué)基礎(chǔ)狀態(tài)，比如軸突填充密度、軸突直徑、髓鞘、神經(jīng)突密度和取向分布[14]。研究驗(yàn)證了FA 值對(duì)卒中后運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的影響[15]。一項(xiàng)薈萃分析的結(jié)果顯示，多數(shù)卒中后運(yùn)動(dòng)研究中，F(xiàn)A 值與運(yùn)動(dòng)恢復(fù)結(jié)果顯著相關(guān)[14]。Sidaros 等[16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A 值與神經(jīng)纖維一致性及髓鞘數(shù)量呈正相關(guān)，F(xiàn)A 值較低可能是由于神經(jīng)纖維的損害或者神經(jīng)纖維一致性降低導(dǎo)致。筆者的研究發(fā)現(xiàn)EX-1D 組大鼠在腦卒中后干預(yù)8周后的rFA 值明顯高于EX-1W 組，且mNSS 評(píng)分出現(xiàn)了相反的結(jié)果，表明腦卒中后1 d 開(kāi)始干預(yù)，可以有效保護(hù)神經(jīng)，改善大鼠的神經(jīng)功能，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。

VEGF 涉及到血管生長(zhǎng)的所有階段，包括神經(jīng)血管的發(fā)育, 由缺氧驅(qū)動(dòng)的現(xiàn)有血管中的新毛細(xì)血管生成, 動(dòng)脈生成及相應(yīng)血壓梯度的吻合小動(dòng)脈通道的擴(kuò)張[17-19]。VEGF 在卒中期間可以保護(hù)缺血性腦梗塞并促進(jìn)閉塞的腦動(dòng)脈再通[20]。此外，VEGF 可以促進(jìn)多種神經(jīng)元功能的恢復(fù)，包括神經(jīng)元發(fā)生、神經(jīng)元遷移、神經(jīng)元生長(zhǎng)等[21]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)8 周干預(yù)結(jié)束后EX-1D 組大鼠的VEGF 表達(dá)水平高于EX-1W 組和SED 組，表明卒中后1 d 開(kāi)始運(yùn)動(dòng)更能上調(diào)VEGF 的表達(dá)。

通過(guò)相關(guān)性分析，筆者發(fā)現(xiàn)VEGF 與mNSS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，而與rFA 值呈正相關(guān)，表明運(yùn)動(dòng)通過(guò)促進(jìn)VEGF 的表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)血管再通和神經(jīng)發(fā)生，從而改善卒中后的病理狀態(tài)。此外，EX-1D 組大鼠在干預(yù)結(jié)束時(shí)更高的VEGF 表達(dá)水平、rFA 值和更低的mNSS 評(píng)分，證明卒中后1 d開(kāi)始的早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果更佳。

本研究揭示了腦卒中后8 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)受損神經(jīng)功能的保護(hù)和改善作用及其內(nèi)在分子機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)卒中后1 d 開(kāi)始運(yùn)動(dòng)擁有更佳的治療效果。但本實(shí)驗(yàn)樣本例數(shù)較少，且早期不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)劃分較為粗放，是否卒中后24 h 內(nèi)或3 d 開(kāi)始運(yùn)動(dòng)干預(yù)會(huì)有更好的治療效果，今后的研究將進(jìn)一步論證。

綜上所述，筆者的研究證明，卒中后1 d 和卒中后1 周進(jìn)行8 周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)，可以通過(guò)上調(diào)大鼠VEGF 的表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和改善作用，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，且卒中后1 d 開(kāi)始干預(yù)的效果更佳。