綠茶中兒茶素的提取工藝優(yōu)化研究

師海榮　謝林燕

摘 要：選取放置了12個(gè)月的綠茶作為試驗(yàn)材料，采用乙醇溶劑提取法，分別使用過濾、離心2種方法提純兒茶素。結(jié)果表明：采用離心操作提純兒茶素的得率是過濾操作的31.3倍;采用離心法進(jìn)行工藝提取后續(xù)操作優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，使用60%的乙醇溶液，pH4.0、料液比1∶20、60℃恒溫水浴超聲提取30min，重復(fù)操作1次，提取完成后，在2000r/min條件下離心2次、使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃前提下蒸發(fā)15min，最后在60℃的真空干燥箱中干燥24h，兒茶素粗提物的得率高達(dá)30.72%。

關(guān)鍵詞：兒茶素;工藝優(yōu)化;離心提取法

中圖分類號(hào) Q946文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）12-0096-05

Abstract： The experimental materials were green tea which was kept for 12 months. After ethanol solvent extraction， catechins were extracted by filtration and? centrifugation respectively. The results showed that the yield of catechin was 31.3 times higher than that of filter operation by centrifugal operation. At the same time， the centrifugal method was optimized. It was found that under the condition of using 60% ethanol solution and pH 4.0， the solid-liquid ratio was 1∶20， and the ultrasonic extraction was carried out at 60℃ for 30 min in a constant temperature water bath， and the operation was repeated once. After extraction， the crude catechin extract was obtained by centrifuging twice at 2000 r/min， evaporating at 60℃ for 15min using a rotary evaporator， and finally drying in a vacuum drying oven at 60℃ for 24 h，and the yield of catechin crude extract is as high as 30.72%.

Key words： Catechin; Process optimization; Centrifugal extraction

茶葉起源于中國，是我國傳統(tǒng)文化的象征，也是當(dāng)今市場上最具有潛力的經(jīng)濟(jì)作物之一。目前，國內(nèi)外學(xué)界普遍認(rèn)為茶多酚是茶葉中的關(guān)鍵物質(zhì)，因此，對(duì)茶多酚的研究很多，而對(duì)兒茶素的研究則相對(duì)較少。兒茶素作為醇類衍生物和還原性多酚類物質(zhì)，其藥用價(jià)值和保健作用也不容小覷[1-2]，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用前景十分可觀。另外，綠茶品質(zhì)的優(yōu)劣也取決于兒茶素的含量與純度，兩者呈正相關(guān)關(guān)系[3]。

當(dāng)前，學(xué)術(shù)界對(duì)兒茶素提取工藝的研究較多，其中，使用最頻繁和操作最便利的是熱水浸提和有機(jī)溶劑浸提2種方法[4]。采用熱水浸提物質(zhì)，兒茶素會(huì)由于受高溫影響而被氧化成其他物質(zhì)，兒茶素得率相應(yīng)的會(huì)有所降低;將熱水改為有機(jī)溶劑來浸提兒茶素物質(zhì)，在一定程度可以抑制其氧化作用，同時(shí)兒茶素的得率也會(huì)有所提高[5]。目前，在兒茶素的提取試驗(yàn)中，大多專注于提取這一整個(gè)過程中的單因素實(shí)驗(yàn)分析，而對(duì)后續(xù)提取兒茶素的分離過程缺乏具體和有效的試驗(yàn)流程和試驗(yàn)分析。為尋求更高的兒茶素得率，本研究將重點(diǎn)探索如何優(yōu)化兒茶素的提取過程效率和后續(xù)分離過程，采取離心提取和過濾提取2種方法來進(jìn)行優(yōu)化。

郭穎等研究表明，溶劑提取法不僅在得率上有所提升，而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)工藝流程原理簡單，易于操作，以乙醇、甲醇、丙酮或熱水來浸提放置12個(gè)月以上的茶葉，選擇合適的溫度和時(shí)間等參數(shù)來提高得率至關(guān)重要[6]。因此，本研究采用70%甲醇溶液進(jìn)行3次提取，并用水定容到50mL或在0.1g樣品加入50%的甲醇水溶液10mL，超聲提取40min均可作為茶兒茶素的前處理提取方法[7]。此外，劉坤等研究發(fā)現(xiàn)，pH對(duì)提取茶兒茶素的穩(wěn)定性有著顯著的影響，提取溶劑中pH環(huán)境對(duì)兒茶素的得率較大[8]。因此，本研究還加入了pH值的變量，選擇用香蘭素-濃鹽酸比色法來測定兒茶素的含量[9-10]，使得試驗(yàn)既經(jīng)濟(jì)且便捷。

1 材料與方法

1.1 供試材料 綠茶葉（成都樂山，2017年06月23日生產(chǎn)）;兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度：99.9%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司）;無水乙醇、無水甲醇、丙酮、鹽酸、香蘭素（均為分析純），均購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別準(zhǔn)確吸取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)樣品液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL于10mL容量瓶中;加入10g/L香蘭素-鹽酸溶液5mL，用無水乙醇溶液定容。取樣于比色皿中，放入在波長為500nm處的紫外可分光光度計(jì)中檢測定，根據(jù)結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 兒茶素的提取 分別準(zhǔn)確稱取烘干、磨碎的陳茶葉1.00g。根據(jù)所設(shè)計(jì)的料液比，加入同濃度的不同的溶劑進(jìn)行浸提，根據(jù)所設(shè)計(jì)的溫度、水浴時(shí)間來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 過濾法 提取工作結(jié)束后，進(jìn)行過濾，合并所得濾液，加入60%乙醇溶劑定容至100mL;吸取其1mL，定容至10mL容量瓶為樣品溶液。

1.2.2.2 離心法 對(duì)陳茶葉進(jìn)行提取操作前，配置一定濃度的檸檬酸溶液來調(diào)節(jié)pH;再將后續(xù)提取的操作改用2000r/min來離心樣品，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮上清液，所得物質(zhì)進(jìn)行真空干燥，取干燥樣品0.02g，溶解于無水乙醇中，定容至10ml容量瓶中，搖勻備用。

1.3 兒茶素含量的測定 吸取樣品溶液1mL于試管中，加入1mL乙醇;再加入香蘭素-鹽酸溶液5mL;混勻后進(jìn)行于500nm處的吸光度值測定;以乙醇加香蘭素-鹽酸溶液作空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線詳見圖1。

2.2 過濾法兒茶素提取的影響因素

2.2.1 溶劑和溫度 分別稱取1.00g磨碎的陳茶葉末，選擇使用均為60%的乙醇、甲醇以及丙酮溶劑，在60℃、70℃的超聲水浴中提取30min，其結(jié)果見圖2。由圖2可知：（1）不同溶劑對(duì)對(duì)兒茶素提取的影響不同，這是因?yàn)椴煌娜軇┓肿樱鄳?yīng)的極性各有差距，導(dǎo)致對(duì)兒茶素的溶解性也不盡相同[11]。（2）溫度對(duì)兒茶素提取效果的影響較大，溫度的提高使溶質(zhì)分子更易溶出，從而提高了兒茶素的得率。但溫度越高，兒茶素的氧化速度也越快，從而在一定程度上降低了兒茶素的純度[12]。由此可知，在70℃同一浸提時(shí)間內(nèi)，兒茶素得率60%乙醇最高，60%，丙酮次之，60%甲醇最低;而在60℃同一浸提時(shí)間里，3種溶劑得率差異不顯著。根據(jù)原料成本以及化學(xué)藥品的危害性，確定使用60%乙醇、60℃最為符合工廠化要求，達(dá)到降低成本和危害性的目的。

2.2.2 料液比 由圖3可知，料液比的不同，即浸提溶劑的量不同，對(duì)兒茶素的浸提效率也是不同的。在料液比逐漸提高的情況下，兒茶素得率逐漸提高;1∶20料液比的得率比料液比1∶10的得率提高1.18倍，顯著提高提取效率;而1∶20料液比的得率與料液比1∶15的得率相比，兩者的得率差異不大。因此，選擇在料液比為1∶15～1∶20的情況下最為合適。

2.2.3 提取次數(shù) 由圖4可知，隨著提取次數(shù)的逐漸增加，兒茶素的提取效率緩慢提升;提取2次的得率比提取1次的得率提升1.3%，而提取3次的得率比提取1次的得率提升1.37%;提取3次與提取2次的得率相差不大。從經(jīng)濟(jì)效率和時(shí)間效率來看，確定提取1～2次較為適宜。

2.3 離心法兒茶素的影響因素

2.3.1 pH值 本次試驗(yàn)在過濾法的基礎(chǔ)上做了改變，試驗(yàn)在進(jìn)行60℃超聲提取前，使用一定濃度的檸檬酸溶液對(duì)提取溶液進(jìn)行pH調(diào)整，以期達(dá)到更好的得率。由圖5可知，不同的pH對(duì)兒茶素得率的影響較大。pH為4時(shí)，兒茶素的粗提取率最高，pH為7最低。兒茶素作為醇類衍生物，在提取過程中因?yàn)樗釅A的條件會(huì)有顯著的變化[8]。本研究顯示，pH4對(duì)兒茶素的提取效果最佳。

2.3.2 離心次數(shù) 兒茶素離心法的最低得率為2.16%，過濾法的最高得率為0.94%，通過比較2種方法的得率，確定使用離心法提取溶液。兒茶素得率在1500～2000r/min時(shí)較好[8]，本研究發(fā)現(xiàn)，1500r/min離心，上清液較混濁，效果不好;而2000r/min離心，上清液澄清，效果較好。因此，采用2000r/min離心，通過增加離心次數(shù)觀察兒茶素提取效果的變化。由圖6可知，隨著離心次數(shù)的增加，兒茶素的得率逐漸提高。其中，1次得率不高，2次或者3次得率提升明顯，因此，確定離心2～3次的得率最好。

2.3.3 蒸發(fā)溫度 經(jīng)過離心之后，試驗(yàn)將會(huì)將其上層清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加熱蒸發(fā)，對(duì)于乙醇來說，其沸點(diǎn)是78℃，試驗(yàn)過程中以水浴鍋溫度來做單因素試驗(yàn)，觀察蒸發(fā)溫度對(duì)兒茶素提取程度的影響。由圖7可知，蒸發(fā)溫度在50～60℃條件下，兒茶素的得率有所提升，但溫度超過60℃，兒茶素得率有所降低;60～70℃的得率提升幅度極高;在70～80℃的得率降低幅度極大。因此，減壓蒸發(fā)的溫度在60～70℃最佳。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 過濾法 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，過濾法中的溶劑種類、料液比、浸提次數(shù)都是影響兒茶素提取效果的重要因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1、表2。

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，選用合適浸提溶劑種類對(duì)兒茶素的提取效果影響顯著，其次為料液比，最后為浸提次數(shù)（表2）。其中，過濾法中提取過程的最優(yōu)水平是A1B3C1，也就是選擇60%的乙醇作為浸提溶劑，在料液比1∶20的情況下，于60℃的超聲波中水浴30min提取1次即可，可以得到最佳的提取效果。

2.4.2 離心法 根據(jù)單因素試驗(yàn)，離心法中的pH、離心次數(shù)、蒸發(fā)溫度都是影響兒茶素提取效果的極為重要的因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3、表4。通過正交實(shí)驗(yàn)可知，pH對(duì)兒茶素提取的影響顯著，蒸發(fā)溫度次之，對(duì)提取陳茶葉中兒茶物質(zhì)影響最小的是離心次數(shù)。最優(yōu)水平則是A1B1C3——pH為4時(shí)，即溶液偏弱酸性時(shí)，提取完成之后，將其離心2次，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中60℃水浴時(shí)，再進(jìn)行真空干燥，為最佳提取工藝。

3 討論

3.1 試驗(yàn)材料的選取對(duì)提取影響不顯著 本次試驗(yàn)使用放置了12個(gè)月的綠茶葉作為原料，以往的文獻(xiàn)資料里面都是選用新鮮采摘的茶葉或者新鮮日期的茶葉，用以提取兒茶素。由于放置過長時(shí)間的茶葉往往口感不佳，而且容易受到潮濕、高溫等影響損壞茶葉質(zhì)量，此次試驗(yàn)選用陳茶，一是省時(shí)省力，減少人工采摘新茶和金錢的消耗，二是有助于環(huán)保，避免浪費(fèi)，達(dá)到廢物利用的效果。根據(jù)劉坤研究結(jié)果顯示，選用市場購買的新鮮茶葉兒茶素提取得率是8.5%[8]，而本次實(shí)驗(yàn)采用放置過久時(shí)間的茶葉來進(jìn)行兒茶素的提取，提取率較高，達(dá)30.72%，提取率大大提高。因此，無論是選用陳茶，還是新鮮茶葉，都可以很好的提取出兒茶素物質(zhì)。最后，若能使用我國每年所浪費(fèi)的茶葉來進(jìn)行兒茶素提取，將可以及時(shí)且快速的消化因口感不佳的陳舊茶葉，得以將那些由于貯藏時(shí)間過長或者因貯藏環(huán)境影響而造成的損失降到最低，改善茶葉行業(yè)的消費(fèi)結(jié)構(gòu)，既滿足了消費(fèi)者選用新鮮茶葉，也發(fā)展了兒茶素的加工生產(chǎn)。因此，發(fā)展陳茶葉中的兒茶素生產(chǎn)加工將具有廣闊的市場前景。

3.2 工藝優(yōu)化優(yōu)勢明顯 現(xiàn)有的研究表明，無論是提取次數(shù)、提取溫度或者料液比都存在差異，但是卻差異不大;不僅如此，大多數(shù)研究還表明，對(duì)兒茶素提取工藝主要是以提取過程做分析和優(yōu)化，對(duì)提取完成后的后續(xù)操作沒未有多做研究[13-22]。因此，在對(duì)提取過程的正交試驗(yàn)分析，體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性。同時(shí)，針對(duì)于后續(xù)提取工作做出改變，力求得到最多的粗提取物，得到最好的工藝優(yōu)化流程。

本研究把過濾法提取工藝和離心法后續(xù)工藝相結(jié)合，得出最優(yōu)的兒茶素提取工藝。這種優(yōu)化后的工藝流程的優(yōu)勢在于以下幾點(diǎn)：（1）原理和操作簡單;（2）整個(gè)工藝中提取所用的試劑是乙醇，易得且價(jià)廉，是任何工廠都不可或缺的東西，容易實(shí)現(xiàn)兒茶素工藝提取的工業(yè)化，而且也不會(huì)造成一些難以挽回的污染;（3）提取所得的兒茶素，其研究價(jià)值前景廣闊。試驗(yàn)中工藝流程優(yōu)化，簡單且資本投入少。任何工藝流程的優(yōu)化都是必不可少的，本次試驗(yàn)所用工藝仍需要再次進(jìn)行研究和探索，后續(xù)的試驗(yàn)研究也會(huì)繼續(xù)跟進(jìn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，兒茶素的最佳提取工藝為：pH=4，料液比為1∶20時(shí)，乙醇濃度60%，在溫度60℃水浴中超聲浸提30min，且僅浸提1次;以上工藝結(jié)束之后，將所得到的提取溶劑離心（2000r/min）2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)溫度60℃的情況下，再經(jīng)過60℃真空干燥24h，可以從陳茶中得到較多的兒茶素提取物。

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（責(zé)編：張宏民）