硫酸軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌的篩選及特性研究

葛雯

摘 要：分離硫酸軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌及克隆其編碼基因是研究其酶學(xué)性質(zhì)及最終實(shí)現(xiàn)低分子量硫酸軟骨素高質(zhì)高效生產(chǎn)的重要研究基礎(chǔ)。本文利用透明圈法從白鰱魚魚腹中分離篩選出產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的S6菌株，經(jīng)16srRNA序列分析，初步鑒定為氣單胞菌，同時(shí)研究了該菌株的生長(zhǎng)曲線和對(duì)抗生素的耐藥性，為后續(xù)針對(duì)S6菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：硫酸軟骨素裂解酶;氣單胞菌S6;抗生素;抗藥性分析;生長(zhǎng)曲線

Abstract：Solation of chondroitin sulfate lyase producing strain and cloning of its coding gene are the important research basis for studying its enzymatic properties and ultimately realizing high quality and efficient production of low molecular weight chondroitin sulfate. In this paper， S6 strain producing chondroitin sulfate lyase was isolated and screened from the belly of silver carp by transparent circle method. After 16s rRNA sequence analysis， it was preliminarily identified as Aeromonas. At the same time， the growth curve and antibiotic resistance of this strain were studied， which laid a foundation for the subsequent study of secondary metabolites of S6 strain.

Key words：Chondroitinase; Aeromonas S6; Antibiotics; Antibiotic resistance; Growth curve

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一種分子量在20～50 ku的酸性黏多糖類生物大分子，廣泛存在于動(dòng)物和人軟骨組織中[1]。其結(jié)構(gòu)是由D-葡糖醛酸與2-乙酰氨基-2-脫氧-硫酸-D-半乳糖組成。硫酸軟骨素具有多種生理與藥理功能和作用，如抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凝血活性的作用[2]，以及在關(guān)節(jié)中的潤(rùn)滑和支撐功能等[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，將硫酸軟骨素的分子量降低至2～10 ku時(shí)，其藥效更為明顯，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性炎癥和傷口愈合有更好的療效[4]。目前生物制藥領(lǐng)域，主要采用硫酸軟素裂解酶（Chondrotinase或Chondrotin sulfate lyase，ChSase）來制備低分子量的硫酸軟骨素，常采用酸水解法、離子交換法和酶解法[2]。其中，酶解法所需要的反應(yīng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單且容易控制，較之前兩者有較高的性價(jià)比和優(yōu)勢(shì)。

酶解法中，硫酸軟骨素酶的主要來自于微生物的發(fā)酵產(chǎn)物。比如，普通變形桿菌（Proteus vulgaris）[5]、肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum）[6]、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）等好氧細(xì)菌一直是主要的硫酸軟骨素酶來源。此外，從多型擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomi-cron）、糞便擬桿菌（Bacteroides stercoris）等厭氧細(xì)菌中也能獲得較高含量的硫酸軟骨素酶[7]。國內(nèi)目前科研和醫(yī)療所需產(chǎn)品主要來自于國外進(jìn)口，價(jià)格相對(duì)昂貴。本研究為實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶生產(chǎn)的可能，在學(xué)習(xí)眾多國內(nèi)外文獻(xiàn)后，從白鰱魚魚腹中分離得到一株產(chǎn)酶活性較高的氣單胞菌S6菌株。通過透明圈變化篩選突變株，并通過進(jìn)一步研究該菌株對(duì)抗生素的耐藥性，為后續(xù)對(duì)硫酸軟骨素裂解酶編碼基因相關(guān)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)以魚、海腸、扇貝、海膽、鮑魚等的內(nèi)臟以及各地土樣作為篩菌樣本來源;抗生素：氨芐青霉素（Am）、卡那霉素（Km）、四環(huán)素（Tc）和氯霉素（Cl）;酶及試劑：質(zhì)粒提取試劑盒購自BIOMIGA公司;各種Tag酶、Extag酶、Buffer、dNTP及其他試劑分別購自Sigma、TAKARA等公司。

1.2 培養(yǎng)基

①LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉，用去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃滅菌30 min。②BBL培養(yǎng)基。（BD公司提供的BactoTM Brain Heart Infusion）牛腦浸出物7.7 g（提自200 g原料），牛心浸出液9.8 g（提自250 g原料），蛋白胨10.0 g，葡萄糖2.0 g，氯化鈉5.0 g，Disodium磷酸鹽2.5 g。將上述混合物按比例取37 g溶于1L去離子水中。加熱溶化并不斷攪拌以混合均勻。在121 ℃下滅菌15 min。③BBL+培養(yǎng)基。BBL培養(yǎng)基148 mL（10.4 g BBL溶于148 mL去離子水中），5%牛血清白蛋白溶液40 mL，2%硫酸軟骨素混合物溶液12 mL，硫酸軟骨素的終濃度為1.2 mg·mL-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）原始菌株的采集。產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的菌株主要是從水生生物的腸道內(nèi)提取。本實(shí)驗(yàn)以魚、海腸、扇貝、海膽、鮑魚等的內(nèi)臟以及各地土樣作為篩菌樣本來源，將采集到的樣品裝于無菌自封袋中保存，并在實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺(tái)上，利用平板劃線單菌落法對(duì)不同的菌落進(jìn)行純化，用于后續(xù)篩選。

（2）產(chǎn)酶菌株的獲取。利用大分子的硫酸軟骨素與適當(dāng)濃度的牛血清白蛋白混合后，與一定濃度的冰醋酸溶液可發(fā)生渾濁反應(yīng)原理，而已被裂解的小分子硫酸軟骨素則不發(fā)生該反應(yīng)的原理，對(duì)菌落平板進(jìn)行透明圈篩選，得到目的菌株[8]。如圖1所示，用平板稀釋分離法分離后的菌株，同時(shí)平行劃短線法接種BBL平板和BBL+平板，菌落編號(hào)要對(duì)應(yīng)。劃完短線的菌置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在長(zhǎng)出菌落的BBL+平板上覆蓋一層濃度為2 mol·L-1的冰醋酸溶液，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈。如產(chǎn)生透明圈，在BBL平板上找到相應(yīng)位置的同一菌株，液體培養(yǎng)后進(jìn)行菌種保存。

（3）菌種鑒定。采用16srDNA PCR的方法得到所篩菌株的16srDNA基因片段，將該序列送去公司測(cè)序，可得全序列編碼，在EzTaxon網(wǎng)站上將測(cè)序得到的基因序列與數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定出所篩得菌株的種屬關(guān)系。

（4）抗生素抗性分析。①本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)所篩選的產(chǎn)酶菌株對(duì)卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性反應(yīng)。將上述各種抗生素配制成濃縮液，過濾除菌后作為貯液備用。使用時(shí)稀釋到所需濃度，等LB培養(yǎng)基的溫度下降到50～60 ℃時(shí)，加入適量的抗生素溶液，制成含抗生素的LB液體培養(yǎng)基若干。②將受體菌株S6在固體LB培養(yǎng)基上活化，28 ℃培養(yǎng)24 h。之后，挑取單菌落接種于10 mL已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后測(cè)OD600值。當(dāng)OD600值為1時(shí)，按1%的接種量，將受體菌株S6接種于含有相應(yīng)濃度抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)72 h后，檢測(cè)其生長(zhǎng)情況。

（5）產(chǎn)酶菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)量。為了解產(chǎn)酶菌株氣單胞菌S6的生長(zhǎng)規(guī)律，為后續(xù)試驗(yàn)做好準(zhǔn)備工作，本實(shí)驗(yàn)用分光光度計(jì)進(jìn)行光電比濁測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線：①挑取S6單菌落，接種于10 mL已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h。②用移液管吸取2 mL菌懸液接入盛有100 ml LB液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，混合均勻后于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)。③比濁測(cè)定：用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定。在培養(yǎng)后每1 h吸取3 mL菌液置于比色皿中測(cè)取吸光值。使其光密度值在0.2～0.8。④需做3次平行試驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù)并根據(jù)數(shù)據(jù)繪出氣單胞菌S6的生長(zhǎng)曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株篩選結(jié)果

根據(jù)大分子的硫酸軟骨素與適當(dāng)濃度的牛血清白蛋白混合后，與一定濃度的冰醋酸溶液可發(fā)生渾濁反應(yīng)，而已被裂解的小分子硫酸軟骨素不發(fā)生該反應(yīng)的原理，對(duì)菌落平板進(jìn)行透明圈篩選。從分離和培養(yǎng)的野生菌中，可得到產(chǎn)生明顯透明圈的菌株（見圖2）。實(shí)驗(yàn)采用定量測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑比值的方法來衡量野生菌產(chǎn)酶效率，統(tǒng)計(jì)測(cè)量結(jié)果見表1。

2.2 野生菌菌種鑒定結(jié)果

由透明圈和菌落直徑的比值可知，S6號(hào)菌產(chǎn)生硫酸軟骨素裂解酶的效率最高，從中選取S6菌株進(jìn)行測(cè)序，并把得到的基因序列與EzTaxon數(shù)據(jù)庫中的菌種序列進(jìn)行同源性比對(duì)，鑒定其種類，可知S6號(hào)菌屬于氣單胞菌，是從白鰱魚魚腹中分離所得。

2.3 產(chǎn)酶菌株S6對(duì)不同抗生素的抗性結(jié)果和分析

分別檢測(cè)S6對(duì)氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素的抗性，結(jié)果表明：S6對(duì)氨芐霉素具有一定的抗性，對(duì)卡那霉素、四環(huán)素和氯霉素基本沒有任何抗性。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

2.4 產(chǎn)酶菌株S6生長(zhǎng)曲線的測(cè)量結(jié)果

在28 ℃搖床中培養(yǎng)已分離純化得到的S6菌株，每隔1 h吸取一定量的發(fā)酵菌液稀釋至所需濃度，使用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)光線下，進(jìn)行光電比濁測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的OD值。注意稀釋后菌液的OD值要位于0.2～0.8。根據(jù)稀釋倍數(shù)換算后得數(shù)據(jù)表格，繪制氣單胞菌S6的生長(zhǎng)曲線如圖3。由圖3知，菌株在生長(zhǎng)2～10 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，在生長(zhǎng)10 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過從魚、海腸、扇貝、海膽、鮑魚等的內(nèi)臟以及各地土樣中篩選，分離得到一株產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶菌株S6，經(jīng)鑒定確定為一種氣單胞菌。通過抗生素抗性分析可知，該產(chǎn)酶菌株對(duì)卡那霉素、四環(huán)素和氯霉素幾乎沒有抗性，是利用Tn5轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒插入進(jìn)行基因郵編的良好目的菌株。另外，通過對(duì)產(chǎn)酶菌株S6長(zhǎng)曲線的測(cè)定，可知該菌株在生長(zhǎng)2～10 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，在生長(zhǎng)10 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期，為后續(xù)針對(duì)S6菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究做好了準(zhǔn)備工作。

參考文獻(xiàn)：

[1]方洋濤，牟海津，楊蘇曉，等.產(chǎn)硫酸軟骨素酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科技，2018，43（12）：1-7.

[2]徐麗萍，姜 喆，姚鵬程，等.硫酸軟骨素提取工藝優(yōu)化及抑菌活性研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，35（5）：573-580.

[3]楊寶華.氨基葡萄糖聯(lián)合硫酸軟骨素治療膝骨關(guān)節(jié)炎的效果[J].臨床醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐，2018，3（35）：83-84.

[4]閻浩林，何漢洲，蔡蘇蘭，等.硫酸軟骨素酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化[J].微生物學(xué)報(bào)，2004（1）：79-82.

[5]Yamagata T，Saito H ，Habuchi O，et al.Purifi-cation and Properties of Bacterial Chondroitinases and Chondrosulfatases[J].The Journal of biological chemistry，1968，243（7）：1523-1535.

[6]Gu K F，Linhard R J，Laliberte M，et al.Purication，Characterization and Speficity of Chondroitin Lyases and Glycuronidase From Flavobacterium Heparinum[J].Biochem Journal，1995，133：383-386.

[7]Ahn M Y，Shin K H，Kim D H，et al.Character-ization of a Bacteroides Species From Human Intestine That Degrades Gy2 cosaminoglycans[J].Canadian Journal of Microbiology，1998，44（5）：423-429.

[8]Kenan G U，Robert J.Purification，characterization and specificity of chondroitin lyases and glycuronidase from Flavobacterium heparinum[J].Biochemical，1995，312，569-577.