HPLC法測(cè)定面包中脫氫乙酸的不確定度評(píng)定

葛靜微 沈瑩萍 馬芮萍 楊陽(yáng)

摘 要：評(píng)定高效液相色譜法測(cè)定面包中脫氫乙酸含量的不確定度。依據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，建立脫氫乙酸不確定度的數(shù)學(xué)模型，并對(duì)各不確定度分量進(jìn)行分析，計(jì)算合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。結(jié)果表明，當(dāng)樣品中脫氫乙酸的含量為0.2547 g·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.0065 g·kg-1（P=95%，k=2），標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合、加標(biāo)回收、重復(fù)性測(cè)量是測(cè)量不確定度的主要來(lái)源。

關(guān)鍵詞：面包;脫氫乙酸;不確定度;高效液相色譜法

Abstract：Uncertainty of determination of dehydroacetic acid in bread was evaluated by high performance liquid chromatography method. The sources of uncertainty in determination of dehydroacetic acid were analyzed according to the national measurement technical specification JJF 1059.1-2012 Evaluation and expression of uncertainty in measurement. The combined uncertainty and extended uncertainty were calculated by establishing mathematical model. The results showed that the expanded uncertainty was 0.006 5 g·kg-1（P=95%，k=2） when the dehydroacetic acid content was 0.2547 g·kg-1， which was greater caused by preparation of standard solution， curve fitting， standard addition recovery and repeatability of determination.

Key words：Bread; Dehydroacetic acid; Uncertainty; High performance liquid chromatography method

脫氫乙酸又名脫氫醋酸，是一種應(yīng)用廣泛的防腐劑，對(duì)霉菌、酵母菌、細(xì)菌具有很好的抑制作用，抑菌效果是苯甲酸的2～10倍，廣泛用于果汁、腐乳、醬菜及糕點(diǎn)中[1]。脫氫乙酸能夠被人體迅速吸收，影響人體的腎臟、肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]，并可能引發(fā)癌癥[3]。我國(guó)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014中規(guī)定[4]脫氫乙酸在面包中的限量是0.5 g·kg-1。因此，對(duì)食品中脫氫乙酸的使用進(jìn)行監(jiān)管顯得尤為重要，而檢測(cè)的準(zhǔn)確性是監(jiān)管的基礎(chǔ)。

不確定度評(píng)估是表示檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要方式，能夠表明結(jié)果的可信賴(lài)程度，是衡量測(cè)量結(jié)果的重要指標(biāo)[5-7]，是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，其數(shù)值的大小反映了測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的高低，并直接與檢驗(yàn)結(jié)果的合格判定相關(guān)[8]。因此，不確定度的分析評(píng)定在日常檢測(cè)工作中極為重要，對(duì)于面包中脫氫乙酸不確定度評(píng)定具有重要意義。

目前，面包中脫氫乙酸含量不確定度評(píng)定尚未見(jiàn)報(bào)道，本文采用GB 5009.121-2016中樣品前處理方法，高液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[9]、JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[10]及其他不確定度評(píng)定方法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定度分析評(píng)定，可為面包中脫氫乙酸含量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室評(píng)定不確定度提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：U3000液相色譜儀配熒光檢測(cè)器和Chromeleon 7色譜工作站，美國(guó)Thermo公司;脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)BW900901-1000-C（1000 μg·mL-1）：壇墨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司;乙酸銨（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、正己烷和硫酸鋅均為分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;超純水（電阻率18.2 mΩ·cm-1）：Millipore純水儀制備。

1.2 試驗(yàn)方法

參考GB 5009.121-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》。

1.2.1 樣品前處理

稱(chēng)取2 g（精確至0.001 g）試樣，置于25 mL離心管中，加入約10 mL水、5 mL硫酸鋅溶液（120 g·L-1），用氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）調(diào)pH至7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。置于離心管中，超聲提取10 min，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入10 mL正己烷，振搖1 min，靜置分層，棄去正己烷層，加入10 mL正己烷重復(fù)進(jìn)行一次，取下層水相置于離心管中，4 000 r·min-1離心10 min。取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（體積比為10∶90），流速為1.0 mL·min-1，等度洗脫;紫外檢測(cè)器：波長(zhǎng)為293 nm。

1.2.3 定量方法

用濃度為1 000 μg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)涑蓾舛确謩e為1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的校準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，外標(biāo)法定量。

1.2.4 脫氫乙酸含量的計(jì)算公式

按照式（1）計(jì)算脫氫乙酸的含量：

（1）式（1）中，X-試樣中脫氫乙酸的含量，單位g·kg-1;C-試樣溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，單位μg·mL-1;C0-空白試樣溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，單位μg·mL-1;V-試樣溶液總體積，單位mL;m-稱(chēng)取試樣的質(zhì)量，單位g;1000-換算因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度及來(lái)源分析

不確定度評(píng)定參數(shù)分為A類(lèi)和B類(lèi)，A類(lèi)評(píng)定是指在規(guī)定測(cè)量條件下測(cè)得量值用統(tǒng)計(jì)分析的方法進(jìn)行測(cè)量不確定度分量的評(píng)定，B類(lèi)評(píng)定是指用不同于測(cè)量不確定度A類(lèi)評(píng)定的方法對(duì)測(cè)量不確定度分量進(jìn)行評(píng)定[9，11]。通過(guò)對(duì)全過(guò)程的分析，脫氫乙酸不確定度的主要來(lái)源有：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合、樣品稱(chēng)量、樣品定容、重復(fù)性測(cè)定和加標(biāo)回收率等。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的不確定度Urel（1）（B類(lèi)）

查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)，脫氫乙酸濃度為1 000 μg·mL-1，不確定度為2%，按均勻分布計(jì)算，包含因子k=2，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（2）

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)中間液配制的不確定度Urel（2）（B類(lèi)）。標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過(guò)程中使用20 μL的移液器吸取

20 μL的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水定容至10 mL容量瓶，20 μL的移液器容量允許誤差4.0%，按均勻分布考慮，k=，移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（移液器）為：

（3）根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[12]，玻璃量器引入的不確定度服從三角分布，包含因子k=，10 mL容量瓶（A級(jí)）最大允許差為±0.020 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)中間液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制的不確定度Urel（3）（B類(lèi)）。用1 000 μL移液器分別移500 μL、100 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 μg·mL-1）于1mL容量瓶中，用水定容，用250 μL移液器移250 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 μg·mL-1）于1 mL容量瓶中，用水定容，再用100 μL移液器移取50 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 μg·mL-1）于1 mL容量瓶中，用水定容，配成濃度分別為1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的校準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。該過(guò)程涉及容量瓶、移液器引起的不確定度。

1 mL容量瓶（A級(jí)）最大允許差為±0.010，服從三角分布，k=，5個(gè)容量瓶相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

1 000 μL移液器吸取500 μL時(shí)容量允許誤差±1.0%，吸取100 μL時(shí)容量允許誤差±2.0%，250 μL移液器吸取250 μL時(shí)容量允許誤差±1.5%，100 μL移液器吸取50 μL時(shí)容量允許誤差±3.0%，按均勻分布，k=，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合引入的相對(duì)不確定度Urel（4）（A類(lèi)）

分別測(cè)定濃度為1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液2次，計(jì)算平均值，得到相應(yīng)的峰面積Y，結(jié)果見(jiàn)表1。

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合得到線(xiàn)性回歸方程及R2。對(duì)樣品進(jìn)行兩次平行測(cè)定，得到樣品濃度平均值C0=10.2541 μg·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值C=7.6 μg·mL-1。由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合引入的不確定度式（12）中，S為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S=0.028 19;k為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的斜率，k=0.437 7;p為對(duì)的測(cè)定次數(shù)，p=2;n為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)，n=5;C為標(biāo)準(zhǔn)工作液的平均濃度，C=7.6 μg·mL-1;（C0-C）=105.146 6;（Ci-C）=241.2。

2.3 樣品前處理引入的不確定度Urel（5）（B類(lèi)）

2.3.1 樣品稱(chēng)量產(chǎn)生的不確定度

2.3.2 樣品定容產(chǎn)生的不確定度

樣品經(jīng)稱(chēng)量、加水和硫酸鋅，氫氧化鈉調(diào)pH后，定容于25 mL，25 mL容量瓶（A級(jí)）容量允差為±0.03 mL，服從三角分布，k=，由容量瓶定容產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由樣品前處理引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.4 重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的不確定度Urel（6）（A類(lèi)）

對(duì)面包中脫氫乙酸含量進(jìn)行8次重復(fù)性測(cè)定，結(jié)果分別為0.253 6、0.255 1、0.253 9、0.251 6、0.254 3、0.256 5、0.255 4 g·kg-1和0.2574 g·kg-1，平均值X為0.2547 g·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度，由重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.5 加標(biāo)回收引入的不確定度Urel（7）

按照1.2.1試驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，在5 μg·mL-1添加水平下，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，添加回收率分別為93.41%、90.53%、91.54%、92.06%和91.35%，平均值為X=91.78%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0.0107，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

2.6.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成：

2.6.2 擴(kuò)展不確定度

3 測(cè)量結(jié)果及不確定度報(bào)告

高效液相色譜法測(cè)定面包中脫氫乙酸的結(jié)果報(bào)告為：

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)測(cè)得當(dāng)面包中脫氫乙酸含量為0.254 7 g·kg-1時(shí)，其測(cè)量不確定度為（0.254 7±0.006 5）g·kg-1（k=2，P=95%）。

面包中脫氫乙酸含量的測(cè)定過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合、樣品前處理、重復(fù)性測(cè)定、加標(biāo)回收率等均會(huì)引入不確定度，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合、加標(biāo)回收、重復(fù)性測(cè)量是測(cè)量不確定度的主要來(lái)源。

因此，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中要定期對(duì)設(shè)備進(jìn)行計(jì)量檢定、期間核查與維護(hù)保養(yǎng)工作[13];要嚴(yán)格把控標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和樣品測(cè)量的過(guò)程，要加強(qiáng)操作人員的培訓(xùn)，提高操作技能，尤其是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程，使用精密度較高的量具、準(zhǔn)確操作，以減少樣品測(cè)量過(guò)程中的誤差，保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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