超聲波輔助提取黃芪中總黃酮最佳工藝

李澤民 秦曉芳 李霞 田舒媛 張妍 王鑫

摘 要：目的：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輔助提取黃芪總黃酮的工藝。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察因素選定乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間等方面，考察指標(biāo)是以總黃酮提取率為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用正交法優(yōu)選最佳提取工藝條件。結(jié)果：其最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度60 ℃，料液比為1∶25（g∶mL），提取時(shí)間為40 min，總黃酮提取率0.446%。

關(guān)鍵詞：黃芪;黃酮;超聲波法;正交法

Abstract：Ultrasonic assisted extraction of total flavonoids in Astragalus membranaceus was optimized by orthogonal experimental design. Methods： Based on the single factor experiment， the factors selected were ethanol concentration， extraction temperature， material-liquid ratio， extraction time， etc. The investigation indicators were based on the total flavonoid extraction rate. The orthogonal extraction method was used to optimize the optimal extraction conditions. Results： The best process conditions were： etanol volume fraction 60%， extraction temperature 60 ℃， material-liquid ratio 1：25（g∶mL）， extraction time 40 minutes， and total flavonoid extraction rate 0.446%.

Key words：Radix astragali; Flavonoids; Ultrasonic method; Orthogonal test

黃芪為豆科植物蒙古黃芪的根及膜莢黃芪的干燥根[1]，主要生產(chǎn)于我國(guó)的北方地區(qū)。黃芪是一種益氣補(bǔ)虛作用的中藥?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，黃芪中含有黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、環(huán)黃芪醇類(lèi)、皂苷類(lèi)等多種生理活性成分[2]。在國(guó)內(nèi)外的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪具有調(diào)節(jié)免疫力[3-6]、抑制腫瘤生長(zhǎng)[7-10]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[11]、降低血糖[12]、抗病毒[13]、治療代謝紊亂[14]、遲發(fā)性神經(jīng)退行性疾病以及延緩衰老[15]等作用。

黃酮類(lèi)化合物的提取方式主要有有機(jī)溶劑萃取法[16]、超聲波提取法[17]、微波萃取法[18]、酶萃法[19]、雙水相提取法[20]和超臨界萃取法[21]等。利用超聲波提取法并設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，研究影響提取黃芪中黃酮類(lèi)化合物的主要因素，對(duì)黃芪總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行不斷的篩選，探求一種省時(shí)、省力、高效的黃芪總黃酮最佳提取工藝，對(duì)黃芪新型藥品和功能食品的開(kāi)發(fā)具有重要意義[22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪（根狀）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇溶液、NaOH、NaNO3、NaNO2、Al（NO3）3·9H2O等均為分析純品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芪總黃酮的提取

將黃芪樣品用粉碎機(jī)攪碎，并將粉末過(guò)篩（60目篩），用石油醚連續(xù)脫脂3次，待脫脂完成后用烘干機(jī)干燥。稱(chēng)取0.50 g脫脂干燥黃芪粉末，放入100 mL的三角燒瓶中，加入一定量的乙醇，在一定條件下提取，過(guò)濾待檢測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱(chēng)取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，120 ℃干燥至恒重，選取70%濃度的乙醇進(jìn)行溶解，并用100 mL容量瓶定容，搖勻即制成質(zhì)量濃度為0.20 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)備6個(gè)25 mL的容量瓶，各加入0.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL和10.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，再分別加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，搖勻靜置5 min;繼續(xù)各加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液，搖勻靜置5 min;再分別加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%NaOH溶液，用70%濃度的乙醇溶液定容至25 mL，搖勻放置10 min;將70%乙醇溶液作為空白對(duì)照，測(cè)定其在510 nm波長(zhǎng)的吸光度。得到線性回歸方程為y=0.507 7x+0.041 1，R2=0.995 9。其中y為吸光度值，x為黃酮的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）。

（2）樣品中總黃酮得率的計(jì)算。取適量黃芪樣品提取液按1.2.2（1）中方法測(cè)定溶液中總黃酮的含量。按照公式（1）算出總黃酮得率。

（1）式（1）中，C-提取液總黃酮質(zhì)量濃度，單位μg·mL-1;a-稀釋倍數(shù);V-提取液體積，單位mL;W-黃芪粉末質(zhì)量，單位mg。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響。在料液比1∶15，乙醇濃度40%，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間50 min，提取1次的條件下，對(duì)超聲功率進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。超聲功率分別設(shè)定60、90、120、150 W和180 W，提取黃芪總黃酮含量并計(jì)算得率。

（2）料液比對(duì)總黃酮得率的影響。在超聲功率120 W，乙醇濃度40%，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間50 min，提取1次的條件下，對(duì)料液比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。料液比分別選取1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，提取黃芪總黃酮含量并計(jì)算得率。

（3）超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。在超聲功率120 W，乙醇濃度40%，料液比1∶15，超聲溫度50 ℃，提取1次的條件下，對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。超聲時(shí)間分別設(shè)定10、20、30、40 min和50 min，提取黃芪總黃酮含量并計(jì)算得率。

（4）超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響。在超聲功率120 W，料液比1∶15，乙醇濃度40%，超聲時(shí)間50 min，提取1次的條件下，對(duì)超聲溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。超聲溫度分別選取40、50、60、70 ℃和80 ℃，提取黃芪總黃酮含量并計(jì)算得率。

（5）乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響。在超聲功率120 W，料液比1∶15，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間50 min，提取1次的條件下，對(duì)乙醇濃度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。乙醇濃度分別選取50%、60%、70%、80%和90%，提取黃芪總黃酮含量并計(jì)算得率。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲時(shí)間和料液比作為考察因素，設(shè)計(jì)四因素三水平即L9（34）的正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 功率對(duì)總黃酮得率的影響

隨著功率的增加，黃酮得率隨其改變，當(dāng)超聲功率為120 W時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，為0.359%;當(dāng)功率繼續(xù)增加時(shí)，黃酮得率逐漸降低。功率對(duì)總黃酮得率的影響見(jiàn)圖1。

2.1.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

為保證原料中的黃酮能完全轉(zhuǎn)移至液相中并獲得較高的提取率，料液比的選取極為重要。由圖2可知，隨料液比的增加，黃酮得率也隨之變化。當(dāng)料液比為1∶25（g∶mL）時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，為0.438%;當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，黃酮得率幾乎無(wú)變化，所以最佳料液比為1∶25（g∶mL）。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

超聲時(shí)間會(huì)影響提取的傳質(zhì)過(guò)程，若超聲時(shí)間過(guò)短，傳質(zhì)就不能達(dá)到平衡，其得率會(huì)偏低;當(dāng)超聲時(shí)間適宜，使傳質(zhì)達(dá)到基本平衡，得率最佳。綜合時(shí)間效益，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，傳質(zhì)基本達(dá)到平衡，黃酮得率較高，為0.387%。超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

2.1.4 溫度對(duì)黃芪總黃酮得率的影響

溫度影響分子的擴(kuò)散，為了增加溶質(zhì)的擴(kuò)散和溶劑的滲透，實(shí)驗(yàn)將超聲溫度作為考察指標(biāo)，隨著溫度的升高，黃酮類(lèi)化合物的得率隨提取溫度的升高而迅速增加，溫度為60 ℃時(shí)提取率高達(dá)0.435%;但隨著進(jìn)一步升溫，黃芪活性成分受損，出現(xiàn)大量雜質(zhì)，使得后續(xù)步驟受到阻礙，綜合考慮，選取超聲溫度為60 ℃。溫度對(duì)總黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

2.1.5 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響

隨著乙醇濃度的增大，得率變化呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，黃酮得率最高，達(dá)到0.377%;隨著乙醇濃度繼續(xù)增加，得率略有減少。這是因?yàn)辄S酮類(lèi)化合物是一個(gè)具有廣泛極性的物質(zhì)群。加入一定量的乙醇，使總黃酮的醇溶性和水溶性得到最大程度的溶解。當(dāng)溶液極性過(guò)高或過(guò)低時(shí)，會(huì)減少黃酮類(lèi)化合物的溶解，導(dǎo)致總黃酮的提取率降低。所以最佳乙醇濃度是60%。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響見(jiàn)圖5。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素實(shí)驗(yàn)是只對(duì)一個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而將其他因素都固定，采用該方法的前提是必需假定各因素之間無(wú)交互作用。如果各因素間存在交互作用，利用這種方法結(jié)論方面會(huì)受到影響。由于試驗(yàn)中大部分因素對(duì)總黃酮提取率的影響不是單一的線性關(guān)系，而是一個(gè)綜合的交叉影響，因此為了尋找黃芪總黃酮的最佳提取條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)合單因素中黃酮得率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）和料液比（D）4個(gè)主要因素考察它們對(duì)總黃酮得率的影響。

由表2可知，總黃酮得率的影響程度各不相同，主次順序?yàn)镈>B>C>A，即料液比對(duì)總黃酮的得率影響最大，其次是提取溫度，再次是超聲時(shí)間，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響最小。由k值確立的最佳組合為A2B3C3D3，即乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間40 min、料液比1∶25（g∶mL）。由于乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響最小，且考慮生產(chǎn)成本，故綜合考慮選取的工藝條件為A1B3C3D3，即乙醇濃度60%、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間40 min、料液比1∶25（g∶mL），其總黃酮得率為0.446%。

3 討論

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)氣良藥。在保健品中，黃芪多與其他補(bǔ)益性中草藥合用，起到保健作用[23]，因此對(duì)黃芪的功能特性進(jìn)行研究，以期擴(kuò)大黃芪的綜合利用?？傸S酮是一種很好的天然抗氧化劑，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取工藝，運(yùn)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究超聲功率、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度等方面對(duì)黃芪總黃酮提取含量的影響。從效率和成本上考慮，該提取工藝簡(jiǎn)單可行，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。因?yàn)樵摲椒梢怨?jié)省大量的時(shí)間和溶劑，降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，為該資源的開(kāi)發(fā)利用提供有益的參考，并提供一些方法學(xué)依據(jù)。

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