我國生物合成D-阿洛酮糖的研究及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展

郭元亨 王靖 王小艷 陶進(jìn) 陳博 李義 佟毅

摘 要：本文主要綜述了我國D-阿洛酮糖（D-psicose，Psi）的研究進(jìn)展及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，包括技術(shù)開發(fā)進(jìn)展、主要研發(fā)單位、技術(shù)開發(fā)中存在的不足，同時闡述了D-阿洛酮糖在我國產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中面臨的問題，包括重疊工作過多、技術(shù)整合不足、技術(shù)集中在上游基因挖掘和菌株構(gòu)建領(lǐng)域、法規(guī)和審批滯后等問題，展望了D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢和需要解決的問題。

關(guān)鍵詞：D-阿洛酮糖;研究;產(chǎn)業(yè)化;進(jìn)展

Abstract：This paper mainly reviews the research progress and industrialization process of D-Psicose （Psi） in China， including research progress， technology distribution and insufficient in technology development. In addition， the problems in the process of D-Psicose industrialization in China were also discussed， including too much repetitive work， Technology integration is weak， research work only concentrated in gene mining and strain construction field， regulations and approvals are relatively lagging behind. At last， the development direction and trend of D-Psicose industry were prospected.

Key words：D-Psicose; Research; Industrialization; Progress

2019年，國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布報告稱，全球20～79歲的成年人中有9.3%患有糖尿病，即4.63億人患有糖尿病。另有110萬20歲以下的兒童和青少年患有I型糖尿病。據(jù)IDF預(yù)測，到2030年，將有5.78億成年人患有糖尿病，到2045年，將有7億人患有糖尿病。另外，65歲以上的人群中，糖尿病患者占1/5。糖尿病醫(yī)療支出占全球健康支出的10%（約7 600億美元）[1]。隨著全球范圍內(nèi)“三高”、肥胖、糖尿病等慢性疾病的發(fā)病率逐年增長，人們對健康生活方式和科學(xué)的飲食習(xí)慣更加重視。2017年國務(wù)院辦公廳發(fā)布的《中國防止慢性病中長期規(guī)劃》（2017—2025年）中指出，以健康促進(jìn)和健康管理為手段，到2020年，慢性病導(dǎo)致的過早死亡率較2015年降低10%。積極開展慢病防治是推動由疾病治療向健康管理轉(zhuǎn)變的重要手段。因此，飲食中糖分的“健康攝取”成為新時代的健康課題。其中，開發(fā)和應(yīng)用D-阿洛酮糖（D-psicose，Psi）、甜菊糖苷、羅漢果甜苷等低熱量甜味劑，以代替（或部分代替）蔗糖、葡萄糖、果糖與麥芽糖等傳統(tǒng)的高熱量甜味劑，是最有效的途徑之一。蔗糖是應(yīng)用最為廣泛、用量最大的傳統(tǒng)高熱量甜味劑，而D-阿洛酮糖是與蔗糖甜度最接近的低熱量甜味劑。

目前，全球已有英國泰萊公司、韓國希杰第一制糖株式會社、安德森全球集團(tuán)和日本松谷化學(xué)等企業(yè)生產(chǎn)和銷售D-阿洛酮糖。我國在此領(lǐng)域起步較晚，近年來也有明顯進(jìn)展。因此，本文就D-阿洛酮糖在我國產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程展開綜述。

1 D-阿洛酮糖簡介

阿洛酮糖是D-果糖（D-fructose，F(xiàn)ru）C-3位的差向異構(gòu)體，是一款新型甜味劑，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示[2]。

D-阿洛酮糖的甜度約為蔗糖的70%，熱量約為蔗糖0.3%[3]。與蔗糖相比，D-阿洛酮糖可同等程度的滿足消費者對甜味的味覺需求[4]，容積特性及口感與蔗糖相近，且同樣能與食物中的氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)[5-6]。因此，D-阿洛酮糖在食藥行業(yè)中是一款蔗糖的替代品。除與蔗糖具有相類似的理化性質(zhì)外，D-阿洛酮糖還具有保健功效。研究人員發(fā)現(xiàn)，D-阿洛酮糖具有控制肥胖和糖尿病的功效，能明顯抑制體重的增加和腹部脂肪的堆積[7-9]。另有動物實驗表明，D-阿洛酮糖可有效降低試驗動物體內(nèi)脂肪的積累，同時可減少肥胖所引起的其他并發(fā)癥[10]。在一項針對健康成年人的研究中發(fā)現(xiàn)，每天攝入超過6.7%總碳水化合物的D-阿洛酮糖，可明顯抑制餐后血糖水平[11]。

2 D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)化涉及領(lǐng)域

D-阿洛酮糖已在國外生產(chǎn)上市，松谷、泰萊、希杰等均有生產(chǎn)銷售D-阿洛酮糖。綜觀D-阿洛酮糖在海外產(chǎn)業(yè)化的過程可以看出，該過程涉及技術(shù)開發(fā)、生產(chǎn)、法規(guī)許可等多個環(huán)節(jié)。

D-阿洛酮糖生產(chǎn)通常是以果糖為底物，在D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的催化作用下生成[12-14]。整個技術(shù)開發(fā)過程包括：指導(dǎo)合成D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶所對應(yīng)的基因挖掘、基因篩選、菌株構(gòu)建、對應(yīng)菌株的發(fā)酵、D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的分離純化、酶制劑加工、酶催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖、D-阿洛酮糖的分離純化與結(jié)晶。所涉及的學(xué)科包括生物信息學(xué)、分子生物學(xué)與合成生物學(xué)、發(fā)酵學(xué)、酶工程學(xué)、生物分離學(xué)、結(jié)晶學(xué)等，詳見圖2。

D-阿洛酮糖的生產(chǎn)受多個因素的交叉影響，需要多部門密切配合。除了涉及技術(shù)放大外，還涉及一整套工藝方法、運行標(biāo)準(zhǔn)、檢測技術(shù)、操作流程追蹤記錄和信息反饋機(jī)制的建立，以及供應(yīng)鏈、安全、環(huán)保等多個環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)。一項新技術(shù)從實驗室到大規(guī)模生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化速率與相關(guān)產(chǎn)業(yè)成熟程度密切相關(guān)。我國的食品加工企業(yè)多為中小型企業(yè)，就產(chǎn)業(yè)與技術(shù)的整合能力、生產(chǎn)運營管理、供應(yīng)鏈管理等方面，與國外食品巨頭（如松谷、CJ、泰萊）相比，尚有一定差距。

國外在D-阿洛酮糖食用安全性及法規(guī)認(rèn)證方面的工作開展較早。日本學(xué)者Shirai等以大鼠做為研究對象[15]，Nishii等[16]以健康狗為研究對象，分別驗證D-阿洛酮糖的食用安全性，結(jié)果均顯示阿洛酮糖無不良影響。此外，希杰第一制糖株式會社在2011年就向美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）申請了關(guān)于D-阿洛酮糖“一般認(rèn)為安全”（GRAS）認(rèn)定，該認(rèn)定于2012年6月得到答復(fù)“沒有問題”（GRASNoticeNo.GRN000400），認(rèn)可甜味劑D-阿洛酮糖可作為食品添加劑使用。松谷集團(tuán)也于2013年向FDA申請其產(chǎn)品D-阿洛酮糖的GRAS認(rèn)定，并于2014年6月得到“沒有問題”的回復(fù)（GRASNoticeNo.GRN000498）。該報告總結(jié)，人體實驗每日攝入31～33 g D-阿洛酮糖無任何副作用的。因此，D-阿洛酮糖被歸類為一種常規(guī)的碳水化合物替代品，且不會造成任何安全問題。2019年4月，F(xiàn)DA宣布將D-阿洛酮糖排除在“添加糖”“總糖”標(biāo)簽之外，意味著D-阿洛酮糖的使用限制進(jìn)一步放寬[17]。

2018年，韓國食品藥物安全部公布食品標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范擬定修改案，其中一條是將D-阿洛酮糖列為一種食品的成分;2020年，韓國發(fā)布《酒稅法實施令》部分修改草案，其中修改內(nèi)容包括在可用于酒類的添加材料中添加了D-阿洛酮糖。2019年，日本衛(wèi)生勞動和福利部批準(zhǔn)將D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶列為食品添加劑并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。

在我國，D-阿洛酮糖行政許可、相關(guān)法規(guī)、申報和制定暫未開始，因此D-阿洛酮糖也無法在國內(nèi)銷售和應(yīng)用。根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新食品原料安全性審查管理辦法》的有關(guān)條例，雖然D-阿洛酮糖已在多個國家廣泛使用，在我國申請行政許可至少還需進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗、3項遺傳毒性試驗、28天經(jīng)口毒性試驗等驗證。這些實驗需花費較長的時間，較大的財力和人力支出，因此各相關(guān)開發(fā)單位應(yīng)通力合作。

3 我國D-阿洛酮糖技術(shù)開發(fā)的進(jìn)展

近年來，我國在D-阿洛酮糖的研發(fā)領(lǐng)域取得了長足的進(jìn)展。據(jù)SooPAT專利搜索網(wǎng)站顯示，自2010年以來，我國境內(nèi)申報的與阿洛酮糖相關(guān)的專利呈快速上升趨勢，詳見圖3。其中50%以上的是由CJ、泰萊及松谷旗下的研發(fā)團(tuán)隊申請公開，另外不到50%由我國研發(fā)單位申請公開。但我國研發(fā)單位發(fā)表的關(guān)于D-阿洛酮糖的文章也呈快速上升趨勢。

雖然我國近年來研究D-阿洛酮糖的單位逐年增長，但對阿洛酮糖進(jìn)行持續(xù)性研究，且研究內(nèi)容涵蓋了D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)化技術(shù)開發(fā)的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)的單位僅有以下幾家單位：中糧營養(yǎng)健康研究院陳博團(tuán)隊[18-19]，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室的江波團(tuán)隊[20-23]，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國家重點實驗室的孫媛霞團(tuán)隊[24-26]，山東百龍創(chuàng)園生物科技股份有限公司的邵先豹團(tuán)隊[27-29]，

上海立足生物科技有限公司[30-32]。雖然也有其他研究單位報道關(guān)于D-阿洛酮糖技術(shù)開發(fā)的研究，如臺灣科技大學(xué)[33]，西安交通大學(xué)[34-35]，以及其他一些企事業(yè)單位和科研院所[36-39]，但基本為零敲碎打，并未持續(xù)性、系統(tǒng)性的推進(jìn)。

這些研究單位中，江南大學(xué)的研究涵蓋基因挖掘和菌株開發(fā)[40-42]，酶的固定化[43-44]，D-阿洛酮糖的分離純化[45-46]。就公布的技術(shù)來看，江波團(tuán)隊開發(fā)的酶以及酶的表達(dá)效果，均不低于國外大公司公布的數(shù)據(jù)。酶和固定化技術(shù)分別用海藻酸鈉包埋和聚多巴胺-磁性Fe3O4納米粒子固定。海藻酸鈉結(jié)構(gòu)松軟而有彈性，放大生產(chǎn)過程中，若用裝柱反應(yīng)，因自身彈性問題，可能堵死空隙，導(dǎo)致液體無法流動;若用攪拌裝置，海藻酸鈉球容易磨碎成為絮凝狀、可壓縮的懸浮物。這種懸浮物因具有可壓縮性，后續(xù)生產(chǎn)難以過濾;因反應(yīng)體系中，糖液濃度較高，比重較大，因此懸浮物與溶液的比重差較小，不易通過離心技術(shù)除去。因此海藻酸鈉包埋技術(shù)不易產(chǎn)業(yè)化放大。聚多巴胺-磁性Fe3O4納米粒子因成本較高，產(chǎn)業(yè)化也比較困難。該團(tuán)隊公布的分離技術(shù)采用了離子交換樹脂，這類技術(shù)容易投產(chǎn)，易于操作，但缺點是分離效率低，耗水量非常大，后續(xù)產(chǎn)品的濃縮過程耗能也較大，會大幅提高成本。總體而言，D-阿洛酮糖技術(shù)開發(fā)過程中，該團(tuán)隊在上游技術(shù)開發(fā)中，與國際先進(jìn)水平基本同步;下游技術(shù)成果的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化，尚有一定難度。

中糧營養(yǎng)健康研究院和中糧生化對D-阿洛酮糖的研究起步較晚，但發(fā)展勢頭強(qiáng)勁。對D-阿洛酮糖的技術(shù)開發(fā)呈現(xiàn)全產(chǎn)業(yè)鏈布局，面向放大生產(chǎn)的特點。其技術(shù)開發(fā)基本涵蓋了D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)化的所有環(huán)節(jié)，包括基因挖掘和菌株開發(fā)[47-48]，酶表達(dá)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)[49]，酶的分離純化和固定化[50]，D-阿洛酮糖的分離純化[51-53]，D-阿洛酮糖的結(jié)晶等環(huán)節(jié)[54-55]。從公布數(shù)據(jù)來看，D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化率和表達(dá)水平與國外報道的最先進(jìn)水平持平。酶的分離是采用低成本，污染小，可放大的技術(shù);固定化采用大孔樹脂，硬度高，結(jié)構(gòu)強(qiáng)度較大，耐磨，可以裝柱催化反應(yīng)，也可以在在攪拌裝置中反應(yīng)，產(chǎn)業(yè)化前景光明。中糧營養(yǎng)健康研究院對D-阿洛酮糖的分離純化采用的是模擬移動床技術(shù)，分離效率高，水耗少，后續(xù)工藝濃縮壓力小。對D-阿洛酮糖的結(jié)晶也開發(fā)了切實可行的工藝。另外，中糧生化有限公司擁有葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的成熟技術(shù)和產(chǎn)業(yè)，其技術(shù)與果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的工藝相近。因此，D-阿洛酮糖在中糧實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化同時擁有原料優(yōu)勢和技術(shù)整合優(yōu)勢。

百龍創(chuàng)園在D-阿洛酮糖技術(shù)開發(fā)方面公布的內(nèi)容較少，除酶的表達(dá)及菌體發(fā)酵工藝外，基本涉及D-阿洛酮糖技術(shù)開發(fā)和各個環(huán)節(jié)，包括酶表達(dá)菌株的培養(yǎng)[56-57]、酶促反應(yīng)和分離[58-59]、結(jié)晶[27]以及D-阿洛酮糖的應(yīng)用[29]。但百龍創(chuàng)園是我國最先生產(chǎn)出D-阿洛酮糖并在海外銷售的公司。

上海立足生物科技有限公司對D-阿洛酮糖的研究涉及了酶的開發(fā)和應(yīng)用[60-61]、D-阿洛酮糖的分離純化[62]、濃縮工工藝[63]以及D-阿洛酮糖的應(yīng)用[64]，但該公司尚未報道生產(chǎn)銷售產(chǎn)品。2018年9月分以來，也未見有新技術(shù)開發(fā)的報道。

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