超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜用于太平洋鱈魚脂質(zhì)輪廓分析

藍(lán)皓慧 王昕岑 張曉梅 張鴻偉 叢培旭 徐杰 薛長湖

摘要建立了超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（UPLCTriple TOFMS/MS）分析脂質(zhì)輪廓的方法。 色譜柱選用ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm× 2.1 mm， 1.7 μm），流動相A為乙腈水（65∶35， V/V），流動相B為異丙醇乙腈（85∶15， V/V），兩者均含5 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸;質(zhì)譜采用IDA自動二級掃描模式。13類脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品在一定濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995，檢出限（LOD）為0.001～0.25 μmol/L，定量限（LOQ）為0.0025～0.2 μmol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10%，大部分標(biāo)準(zhǔn)品的回收率大于80%。采用氯仿甲醇（2∶1，V/V）提取太平洋鱈魚肌肉組織中的脂質(zhì)，共鑒定出498個(gè)脂質(zhì)分子種類，包括255個(gè)磷脂、52個(gè)鞘脂、191個(gè)甘油酯，主要亞類分別為磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、甘油二酯。本方法具有高靈敏、高分辨和高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于太平洋鱈魚脂質(zhì)輪廓的分析，為脂質(zhì)組學(xué)在水產(chǎn)品領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞脂質(zhì)輪廓; 超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜; 磷脂; 鞘脂; 太平洋鱈魚

1引 言

脂質(zhì)組學(xué)是代謝組學(xué)的一個(gè)分支，是對脂質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)分析的一門學(xué)科，主要研究內(nèi)容為脂質(zhì)及其代謝物的分析鑒定、脂質(zhì)的生物功能與代謝調(diào)控、脂質(zhì)的代謝途徑及網(wǎng)絡(luò)等[1]。自2003年被提出后[2]，脂質(zhì)組學(xué)得到了快速發(fā)展，在結(jié)腸癌[3]、肝癌[4]等多種癌癥的臨床早期預(yù)防和篩查、代謝疾病的檢測[5，6]、脂質(zhì)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)[7]和藥物靶點(diǎn)的鑒定[8]等研究中發(fā)揮了重要作用。近年來，脂質(zhì)組學(xué)被逐漸應(yīng)用于食品領(lǐng)域，為食品組分的脂質(zhì)分析提供了快速、準(zhǔn)確、高通量的方法[9，10]，同時(shí)也為食品摻假分析和溯源追蹤提供了新的研究思路。張耀利等[11]建立了基于大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜快速分析食用油中甘油三酯的方法，發(fā)現(xiàn)了泔水油和煎炸油的差異。Li等[12]采用超高液相色譜串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜分析羊奶、豆奶、牛奶的脂質(zhì)組成，篩選出可作為牛奶類型區(qū)分的14種脂質(zhì)標(biāo)志物，為奶類鑒定和摻假分析提供了依據(jù)。

由于食品脂質(zhì)組學(xué)發(fā)展較晚，水產(chǎn)品中脂質(zhì)種類和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此，關(guān)于水產(chǎn)品脂質(zhì)組學(xué)的研究還處于初期階段。Chen等[13]采用“鳥槍法”脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)對牡蠣中的磷脂進(jìn)行了分析，其中包括29種磷脂酰膽堿、23種磷脂酰乙醇胺、11種磷脂酰絲氨酸、6種磷脂酰肌醇和17種溶血型磷脂?！傍B槍法”脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)通常采用直接進(jìn)樣，大大縮短了分析時(shí)間，但難以分析低豐度的脂質(zhì)。Song等[14]建立了快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜（REIMS）鑒別鮭魚和虹鱒魚脂質(zhì)的方法，共鑒定出12種脂肪酸和37種磷脂分子，用于鮭魚產(chǎn)品真實(shí)性的判斷依據(jù)。盡管REIMS技術(shù)在食品真?zhèn)渭百|(zhì)量快速檢測領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景，但其主要應(yīng)用于定性分析，而難以用于定量分析。叢培旭等[15]建立了高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（HPLCQQQMS/MS）定量檢測海參和海膽中單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的分析方法，HPLCQQQMS/MS比較適合脂質(zhì)成分的定量分析，但其分辨率較低，易受相近m/z的離子干擾。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（UPLCTriple TOFMS/MS）具有高通量、高分辨率、高速等優(yōu)點(diǎn)，通過一次進(jìn)樣即可實(shí)現(xiàn)對多種脂質(zhì)分子準(zhǔn)確地定性和定量分析[16]。

太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus），又名為大頭魚，為生活在海洋底層的冷水性魚類，廣泛分布于中國的黃海和渤海地區(qū)[17]， 肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高，是重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一[18]。然而，有關(guān)太平洋鱈魚脂質(zhì)的研究報(bào)道較少。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（UPLCTriple TOFMS/MS）建立了水產(chǎn)品脂質(zhì)輪廓分析方法，對流動相中甲酸銨濃度和質(zhì)譜碰撞能進(jìn)行了優(yōu)化， 用于太平洋鱈魚的脂質(zhì)種類及含量分析和營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Nexera UHPLC LC30A超高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）; TripleTOF 5600高分辨質(zhì)譜儀和Analyst 1.6.3、PeakView 2.2、MultiQuant 3.0數(shù)據(jù)處理軟件（美國AB Sciex公司）; ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）; Hypersil GOLD柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm，美國Thermo Scientific公司）; MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）; DUC1C氮吹儀（日本Taitex公司）; CP1MX高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）。

氯仿、甲醇、異丙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）; 氯仿、甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）; 甲酸、甲酸銨（色譜純，美國SigmaAldrich公司）; 脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品： 溶血磷脂酰膽堿LPC （19∶0）、磷脂酰膽堿PC （14∶0/14∶0）、溶血磷脂酰乙醇胺LPE （14∶0）、磷脂酰乙醇胺PE （14∶0/14∶0）、磷脂酰絲氨酸PS （14∶0/14∶0）、磷脂酰甘油PG （14∶0/14∶0）、磷脂酸PA （14∶0/14∶0）、磷脂酰肌醇PI（混標(biāo)）、鞘磷脂SM （d18∶1/12∶0）、神經(jīng)酰胺Cer （d18∶1/17∶0）、腦苷脂GalCer （d18∶1/12∶0）、甘油二酯DAG （17∶0/17∶0）、甘油三酯TAG （17∶0/17∶0/17∶0）（美國Avanti Polar Lipids公司）。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.3LCMS/MS分析

2.3.1色譜條件色譜柱： ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm）; 柱溫： 50℃; 自動進(jìn)樣器溫度： 4℃; 流動相A為乙腈水（65∶35， V/V），流動相B為異丙醇乙腈（85∶15， V/V），兩者均含5 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸。梯度洗脫： 0～2 min，85%～70% A; 2～3 min，70%～60% A; 3～15 min，60%～25% A; 15～20 min，25%～1% A; 20～25 min，1% A; 25～26 min，1%～85% A; 26～30 min，85% A。流速： 0.35 mL/min。

2.3.2質(zhì)譜條件電離模式： ESI+和ESI-（各脂質(zhì)的電離模式見表2）; 噴霧電壓（ISVF）： ±5500 V; 離子化溫度（TEM）： 500℃; 霧化氣（GS1）： 50 psi（1psi=6.89 kPa），輔助加熱（GS2）： 50 psi; 氣簾氣（CUR）： 35 psi; 掃描范圍： m/z 150～1200; IDA自動二級掃描模式; 碰撞能： 45 eV; 進(jìn)樣量： 5 μL。

2.4樣品處理

采用Folch法提取樣品脂質(zhì)[19]。取0.5 g粉碎的魚肌肉組織，置于具塞離心管中，重復(fù)做6個(gè)平行，分別加入9 mL氯仿甲醇（2∶1， V/V），冰浴下均質(zhì)，振蕩提取10 min，再加入3 mL超純水，渦旋1 min，4℃下5000 g離心10 min，收集下層溶液，上層水相再加入9 mL氯仿甲醇（2∶1， V/V）重新提取，合并下層溶液。40℃下，N2吹至干得到總脂，用1 mL異丙醇乙腈（2∶1， V/V）復(fù)溶， 過0.22 μm有機(jī)濾膜后，Symbolm@@20℃保存，待測。

2.5數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入LipidView進(jìn)行非靶向定性分析，在脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索母離子和子離子碎片信息，分析結(jié)果輸出后，導(dǎo)入PeakView進(jìn)行靶向定性分析，查看每個(gè)脂質(zhì)分子種的色譜、一級和二級質(zhì)譜信息，確定分子種組成、保留時(shí)間和特定碎裂行為，手動過濾假陽性結(jié)果。脂質(zhì)定性結(jié)果直接導(dǎo)入MultiQuant進(jìn)行定量分析，最終獲得準(zhǔn)確的脂質(zhì)含量信息。

3結(jié)果與討論

3.1色譜條件的優(yōu)化

3.1.1色譜柱的選擇選擇Hypersil GOLD柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm）和ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm）兩種色譜柱，采用表1中C3的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，考察各類脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流色譜的保留時(shí)間、峰強(qiáng)度和峰寬，結(jié)果見表3。ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱利用橋式亞乙基雜化顆粒技術(shù)控制顆粒表面電荷數(shù)量，為小分子化合物分析提供良好的峰形和柱效，所以大部分脂質(zhì)的峰寬在0.3 min內(nèi)，相比于Hypersil GOLD色譜柱，色譜峰的峰形和響應(yīng)值均更佳。此外，ACQUITY UPLC CSH C18柱可在30 min內(nèi)完成所有脂質(zhì)成分的洗脫和分離，更適合快速高通量分析。因此，選用ACQUITY UPLC CSH C18柱（2.1 mm×150 mm， 1.7 μm）作為分析柱。

3.1.2流動相中甲酸銨濃度的優(yōu)化通過改變流動相中甲酸銨的濃度（0、5和10 mmol/L），采用表1中C3的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，考察各類脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流色譜峰峰寬和峰強(qiáng)度，確定最優(yōu)的甲酸銨濃度。結(jié)果表明，甲酸銨濃度對部分磷脂的峰形有很大影響，PI、PG和PS的峰形在一定程度上得到了改善，

3.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

設(shè)定碰撞能（CE）分別為30、45和60 eV，對標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)行分析，確定最優(yōu)CE。結(jié)果表明，當(dāng)CE=45 eV，CES=15 eV時(shí)，能夠獲得清晰的特征碎片信息，可得到滿意的質(zhì)譜結(jié)果。

3.3脂質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

不同類別的脂質(zhì)化合物在二級質(zhì)譜中具有特征裂解規(guī)律，在不同的化學(xué)鍵位點(diǎn)斷裂而產(chǎn)生特異性產(chǎn)物離子或中性丟失碎片離子，13類脂質(zhì)的碎片離子見表2。根據(jù)各類脂質(zhì)裂解規(guī)律，鑒定脂質(zhì)組分的結(jié)構(gòu)。以PE （16∶0/20∶5）和DG （18∶4/20∶5）兩種脂質(zhì)分子為例，在負(fù)離子模式下，PE （16∶0/20∶5）形成分子量為736.4958的[M-H]準(zhǔn)分子離子，m/z 140.0137和196.0397為PE的特征子離子，m/z 255.2346和301.2191分別是斷裂的C18∶4和C20∶5脂肪酸失去一個(gè)氫原子產(chǎn)生的碎片離子（圖2A）。在正離子模式下，DG （18∶4/20∶5）與流動相中的NH+4結(jié)合，形成分子量為652.4943的[M+NH4]+， m/z 333.2410和359.2558分別是酯鍵斷裂后丟失C20∶5和C18∶4脂肪酸產(chǎn)生的碎片離子（圖2B）。

3.4方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1線性范圍按表1中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度從低到高（C8～C0）順序依次進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，以各類脂質(zhì)分子的峰面積平均值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各類脂質(zhì)對應(yīng)的線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、線性范圍見表4，在一定濃度范圍內(nèi)，回歸系數(shù)均大于0.995，表明線性關(guān)系良好。

3.4.2靈敏度將表1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度從低到高（C8～C0）依次進(jìn)樣，以信噪比S/N=3時(shí)的濃度為檢出限（LOD）， S/N=10時(shí)的濃度為定量限（LOQ）。各類脂質(zhì)的檢出限和定量限見表4。由于拖尾問題影響色譜峰形，PA檢測靈敏度略低，除PA外，其它脂質(zhì)均有較高的檢測靈敏度。

3.4.3精密度和回收率分別在0.5 g魚肉組織中加入表1中C3濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.4節(jié)進(jìn)行樣品處理，記作樣本1; 不加魚肉組織進(jìn)行同樣處理，記作樣本2; 加入魚肉組織，不加標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行相同處理，記作樣本3。樣本1按照方法分析6次，用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評價(jià)精密度。分別測定樣本1、2、3，測得峰面積，并按照公式（1）計(jì)算回收率（R，%）：

R（%）=（ATest-ASample）AStandard×100%（1）

方法的精密度和回收率見表4。13類脂質(zhì)的精密度均小于10%，且大部分脂質(zhì)的回收率都高于80%，表明方法的精密度和回收率良好。

3.5方法應(yīng)用

利用上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法，對太平洋鱈魚的脂質(zhì)輪廓進(jìn)行分析，通過外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對樣品中的各類脂質(zhì)進(jìn)行定量分析。圖3A和B為太平洋鱈魚脂質(zhì)提取物的正負(fù)離子總離子流圖，各類脂質(zhì)的保留時(shí)間見表5。在太平洋鱈魚中共鑒定出498個(gè)脂質(zhì)分子種類，包括255個(gè)磷脂、52個(gè)鞘脂、191個(gè)甘油酯（表5）。根據(jù)定量分析結(jié)果計(jì)算出鱈魚中各類脂質(zhì)百分含量（圖4）。結(jié)果表明，鱈魚中的脂質(zhì)主要為甘油酯和磷脂; DAG是甘油酯的主要成分，占總脂質(zhì)47.3%; PE為鱈魚磷脂的最主要成分，占總脂質(zhì)13.0%; 鞘脂中SM含量最高，占總脂質(zhì)2.4%。

分析結(jié)果表明，太平洋鱈魚中磷脂占總脂質(zhì)的34.0%，且含有7種不同的磷脂亞類，PC和PE為主要的磷脂亞類，二十碳五烯酸（EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（DHA，C22∶6）是磷脂中主要的脂肪酸（圖3C）。已有研究表明，海水魚與淡水魚的脂肪酸組成不同，海水魚中DHA和EPA的比例最高[20]，而淡水魚中花生四烯酸（AA，C20∶4）和二十二碳五烯酸（DPA，C22∶5）的比例較高; 海水魚磷脂中DHA和EPA的含量比山羊奶、豆奶和牛奶中高得多[11]。因此，太平洋鱈魚磷脂種類豐富、含量高，且富含DHA和EPA，是磷脂的良好來源。

對鞘脂分析發(fā)現(xiàn)，SM、Cer和腦苷酯（HexCer）是太平洋鱈魚的鞘脂成分，其中SM和Cer是其主要成分。由圖3D可知，d19∶3為Cer中含量最高的長鏈堿（LCB），其次是d18∶1，d19∶3在哺乳動物中比較罕見[12]。鞘脂在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長到細(xì)胞死亡和衰老等多種生物過程中發(fā)揮著重要作用[21]，近年來， 鞘脂生物活性的研究報(bào)道逐漸增加，而對魚類脂質(zhì)的研究主要集中在多不飽和脂肪酸（PUFA）、磷脂和甘油酯方面[22]。因此，本研究對鞘脂進(jìn)行了分析，有助于深入了解太平洋鱈魚的脂質(zhì)代謝和營養(yǎng)價(jià)值。

4結(jié) 論

建立了基于UPLCTriple TOFMS/MS脂質(zhì)輪廓分析方法。方法線性范圍寬，靈敏度、精密度和回收率均較高，滿足脂質(zhì)組學(xué)高通量定性和高準(zhǔn)確度定量分析的要求。對太平洋鱈魚脂質(zhì)分子種類和含量進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究，單次進(jìn)樣即可鑒定出498種脂質(zhì)分子，包括255種磷脂、52種鞘脂、191種甘油酯。本研究分析的眾多脂質(zhì)分子種類可為鱈魚營養(yǎng)價(jià)值研究提供可靠的依據(jù)，所建立的分析方法將為水產(chǎn)品脂質(zhì)組學(xué)提供方法學(xué)支持，為脂質(zhì)組學(xué)在水產(chǎn)品科學(xué)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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