生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的酶法輔助提取及抑菌活性分析

郭春曉，文子萱，劉子涵，徐元晶

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165）

生姜（Rhizoma Zingiberis Recens），屬單子葉植物綱，大多具有塊狀根，通常具有芳香氣味，原產(chǎn)于太平洋群島，現(xiàn)多栽植于我國(guó)中部、東南部及西南部各省市. 作為食藥兩用植物，生姜具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其可食用部分高達(dá)95%，生姜日?？勺鳛槭卟耸秤茫挚勺髡{(diào)味品被人們廣泛使用[1].

生姜具有較高的藥用價(jià)值，含有多種功能因子，如具有辣味效應(yīng)的姜辣素、姜酚和姜酮等，具有揮發(fā)性的油物質(zhì)類(lèi)等. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，生姜具有緩解腸胃、解毒、促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)心臟功能、降低血糖、保護(hù)膽臟和肝臟、殺菌，增強(qiáng)免疫力，減少機(jī)體炎癥、抗氧化作用和抗過(guò)敏、促使腫瘤細(xì)胞死亡等方面的重要功效[2]. 其中生姜中黃酮類(lèi)化合物是一種重要的活性物質(zhì)，具有抗菌、抗炎、保護(hù)心血管、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能. 目前，黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取方法及其活性研究已成為研究熱點(diǎn)之一[2-5].

近年的許多研究都涉及提取方法的優(yōu)化，如：超聲輔助提取、微波輔助提取、酶解提取等. 于潔等對(duì)生姜黃酮的提取及性能進(jìn)行了研究[6]，劉玉梅等研究了復(fù)合酶協(xié)同超聲波法提取香椿老葉總黃酮的工藝條件[8]. 植物細(xì)胞壁中含有的果膠類(lèi)、纖維素等成分使用纖維素酶可將其分解，促進(jìn)功效成分的溶出，提高提取率，且與乙醇聯(lián)用還具有協(xié)同作用. 故本文擬對(duì)酶法輔助提取生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的工藝條件進(jìn)行研究，以所得的生姜黃酮類(lèi)提取液為試驗(yàn)材料，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌、黑曲霉為供試菌種，對(duì)生姜黃酮物質(zhì)的抑菌活性進(jìn)行試驗(yàn)分析；以對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果為指標(biāo)，研究不同條件下生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑菌效果，以期為生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜：市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi). 要求本色淡黃，飽滿(mǎn)而有光澤，根莖較完整，姜肉質(zhì)感較硬，沒(méi)有爛心和爛頂?shù)奶卣?、不蔫萎、也沒(méi)有明顯的蟲(chóng)傷，表皮泥土較少、比較潔凈，沒(méi)有長(zhǎng)或短的根須，沒(méi)有受熱、受凍的腐爛現(xiàn)象.

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、纖維素酶、大腸桿菌（Escherichiacoli）、青霉菌（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubitlis）、無(wú)水乙醇（AR）、亞硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）等.

1.2 儀器與設(shè)備

AlphaClean 1300 超凈工作臺(tái)、紫外分光光度計(jì)、LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋、KQ3200 超聲波清洗器、移液槍、IGS180恒溫培養(yǎng)箱等.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取

用清水洗凈生姜上的泥土沙塵，然后進(jìn)行晾干處理. 將晾干后的生姜樣品切碎成小塊，將小塊放入烘箱中，溫度調(diào)節(jié)為60 ℃左右，進(jìn)行為期一天的干燥操作. 取出后，將已干燥完全的小塊研磨成細(xì)細(xì)的粉狀物質(zhì)，密封后置于適宜條件下保存，備用.

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的生姜粉末，于50 mL 圓底離心管中，加入適量纖維素酶溶液，選擇合適條件提取一段時(shí)間后，95 ℃滅活酶10 min，再加入適量無(wú)水乙醇配制成80%濃度的乙醇溶液，在一定時(shí)間和溫度下進(jìn)行超聲提取[7].

1.3.2 總黃酮得率計(jì)算

分別準(zhǔn)確量取濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液（1.00、2.00、3.00、4.00、5.00）mL 于25 mL 容量瓶中，分別加入2 mL 0.5 mol/L AlCl3溶液，顯色，采用pH值5.8的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液定容，超聲振蕩5 min，靜置15 min，得5個(gè)濃度的蘆丁測(cè)定液.

經(jīng)光譜掃描得最大吸收波長(zhǎng)為415 nm，于415 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），對(duì)不同濃度（C）蘆丁和相對(duì)應(yīng)的吸光度（A）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=31.72x-1.05 (R2=0.9963)，在（8 ～40）μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好[8].總黃酮得率按下式計(jì)算：

1.3.3 生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑菌試驗(yàn)

取供試菌種，細(xì)菌用牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)24 h，霉菌用PDA 培養(yǎng)基29 ℃下培養(yǎng)48 h.利用接種環(huán)挑取活化過(guò)的菌種一環(huán)，用10 mL 無(wú)菌水制成菌懸液，備用.

采用濾紙片擴(kuò)散法[9-10]測(cè)定黃酮類(lèi)物質(zhì)抑菌活性. 將經(jīng)過(guò)滅菌操作的濾紙片（直徑為6 mm），放入黃酮提取液，處理時(shí)間約為12 h，然后晾干，備用.吸取0.2 ml 菌懸液均勻涂抹到平板上，生姜提取液的濾紙圓片（6 mm)放到涂有菌液的平板上，每平板上貼4片濾紙片，另外貼1片已滅菌的紙片作空白對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行兩次，記錄其抑菌強(qiáng)度[11].

以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉菌、黑曲霉為供試菌種，選擇1.0%、1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、8.0%、10.0%的生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)提取液. 考察不同濃度的提取液對(duì)上述菌種的抑菌效果，研究其最小抑菌濃度[12].

1.3.4 不同pH值對(duì)生姜黃酮化合物抑菌作用的影響

取6 份相同提取液，利用0.1 ml/mL 的HCl 溶液、0.1 mol/mL 的NaOH 溶液，調(diào)節(jié)pH 值為2、4、6、8、10、12，室溫下靜置12 h[13]. 采用濾紙片擴(kuò)散法，重復(fù)多次測(cè)定抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值，考察pH 值對(duì)生姜黃酮化合物抑菌作用的影響.

1.3.5 不同溫度對(duì)生姜黃酮化合物抑菌作用的影響

取6 份等量的黃酮提取液，然后分別放置于（20、40、60、80、100、120）℃下，其他條件相同，處理時(shí)間都為20 min[14].采用濾紙片擴(kuò)散法，重復(fù)多次測(cè)定抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值，考察不同溫度處理對(duì)生姜黃酮化合物抑菌作用的影響.

1.3.5 光照時(shí)間對(duì)生姜黃酮化合物抑菌作用的影響

取6 份等量的黃酮提取液，然后置于相同的白熾燈下，進(jìn)行照射，放置時(shí)間以10 min 為起始點(diǎn)，每10 min為一梯度，至60 min.采用濾紙片擴(kuò)散法[9-10]，重復(fù)多次測(cè)定抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值，考察光照時(shí)間對(duì)生姜黃酮化合物抑菌作用的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶法輔助提取生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)工藝條件

根據(jù)文獻(xiàn)資料，選擇纖維素酶水解生姜提取黃酮類(lèi)物質(zhì)，以酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH 為因素，采用L9(34)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶法提取生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)表如表1 所示，以黃酮類(lèi)物質(zhì)的得率為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶法輔助提取生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)

基于表2，根據(jù)極差分析，4 個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響大小順序?yàn)椋篊＞D＞A＞B，即pH＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶用量，適宜的提取條件是酶解時(shí)間80 min，酶用量1.4%、pH值6，酶解溫度45 ℃.

2.1 生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑菌活性試驗(yàn)結(jié).

生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌、黑曲霉的抑菌活性試驗(yàn)，結(jié)果如表3 所示. 生姜黃酮對(duì)各菌種都有一定的抑菌效果. 按照對(duì)菌種的抑菌強(qiáng)度進(jìn)行排序，順序依次為枯草芽孢桿菌＞黑曲霉＞金黃色葡萄球菌＞青霉菌＞大腸桿菌. 實(shí)驗(yàn)測(cè)得，對(duì)上述菌種的最小抑菌濃度按照大小排序，分別為大腸桿菌（10%）＞青霉菌（6%）＞金黃色葡萄球菌（4.5%）＞黑曲霉（3%）＞枯草芽孢桿菌（1.5%）.

表3 生姜黃酮的抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示無(wú)抑菌圈，“+”表示有抑菌圈

2.2 不同pH對(duì)生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)抑菌作用的影響

pH 對(duì)生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)抑菌效果的研究結(jié)果如表4 所示. 在pH 值為2-6 時(shí)，抑菌圈觀測(cè)為最大，抑菌較穩(wěn)定；在pH 值為6-10的范圍內(nèi)，抑菌圈直徑有所變化，呈縮小趨勢(shì)，但變動(dòng)幅度較小；當(dāng)pH值大于10 時(shí)，抑菌圈的直徑大小明顯縮小. 因此，微生物在較酸性的條件下不宜生長(zhǎng)，此時(shí)的抑菌效果也較好，且pH值為4時(shí)抑菌強(qiáng)度最大.

表4 不同PH值對(duì)生姜黃酮抑菌作用的影響

2.3 不同溫度對(duì)生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)抑菌作用的影響

溫度因素對(duì)生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)抑菌效果的研究結(jié)果如表5所示.隨溫度的不斷增高，抑菌圈直徑的大小先增大后縮小，達(dá)到（80 ～100）℃時(shí)為最高，當(dāng)溫度更高后，其值略有下降. 因此溫度為80 ℃左右時(shí)抑菌作用性最好.原因可能為：隨溫度升高，水分逐漸蒸發(fā)，導(dǎo)致黃酮提取物的溶解度增加，抑菌作用也隨之增加，但當(dāng)溫度更高時(shí)，化合物的結(jié)構(gòu)在高溫下被破壞，所以抑菌作用逐漸變差[15]. 值得一提的是，高溫時(shí)抑菌作用變化并沒(méi)有很明顯，說(shuō)明黃酮提取物在高溫下也可以發(fā)揮作用.

表5 不同溫度對(duì)生姜黃酮抑菌作用的影響

2.4 光照時(shí)間對(duì)生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)抑菌作用的影響

光照時(shí)間對(duì)生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)抑菌效果的研究結(jié)果如表6所示.隨著光照時(shí)間的增加，抑菌圈直徑不斷縮小. 因此，為獲得更好的儲(chǔ)藏效果和抑菌效果，可將生姜置于避光條件下儲(chǔ)存.

表6 不同光照時(shí)間對(duì)生姜黃酮抑菌作用的影響

3 結(jié)論

本文采用酶法輔助提取生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了其提取條件，適宜的提取條件是酶解時(shí)間80 min，酶的用量1.4%、pH 值6，酶解溫度45 ℃，同時(shí)研究了生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌、黑曲霉的抑菌活性，生姜黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)各菌種都有一定的抑菌效果. 按照對(duì)菌種的抑菌強(qiáng)度進(jìn)行排序，順序依次為枯草芽孢桿菌＞黑曲霉＞青霉菌＞大腸桿菌. 實(shí)驗(yàn)測(cè)得，對(duì)上述菌種的最小抑菌濃度按照大小排序，分別為大腸桿菌（10%）＞青霉菌（5%）＞黑曲霉（3%）＞枯草芽孢桿菌（1.5%）. 選擇pH 值為2-6，溫度為80 ℃，避光條件下可以黃酮類(lèi)物質(zhì)可以獲得較好的抑菌效果.

生姜作為一類(lèi)同時(shí)具有食藥功能的物質(zhì)，其發(fā)展和研究?jī)r(jià)值仍在探索之中. 作為生姜中的抑菌性物質(zhì)，黃酮具有較強(qiáng)的抑菌作用，可用作良好的抑菌劑，生姜中其他具有抑菌作用的成分也值得去進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用，以期得到最佳的利用效果，提供生姜這一植物的利用加工，提高其附加值.