Zn-MT對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心肌抗氧化酶及細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量的影響

李 峰

Zn-MT對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心肌抗氧化酶及細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量的影響

李 峰

西安建筑科技大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安，710055。

目的：探討鋅-金屬硫蛋白（Zn-MT）對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠（♂）心肌細(xì)胞抗氧化酶、細(xì)胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響。方法：選取雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組（A）、補(bǔ)充Zn-MT +運(yùn)動(dòng)組（B），兩組大鼠均進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。于力竭運(yùn)動(dòng)后即刻取材，抗氧化酶采用比色法，心肌凋亡細(xì)胞檢測(cè)采用TUNEL法，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化法。結(jié)果：C組和B組相比，C組GSH-Px、CAT、GSH、SOD活性有不同程度的升高；可以明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)率，Bcl-2表達(dá)明顯增高。結(jié)論：補(bǔ)充Zn-MT可以MT可以提高心肌抗氧化酶活性，通過(guò)影響心肌細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，減少力竭運(yùn)動(dòng)后的心肌細(xì)胞凋亡。

鋅-金屬硫蛋白；抗氧化酶；力竭；心肌凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

研究運(yùn)動(dòng)與抗氧化酶、細(xì)胞凋亡的關(guān)系的研究是探討運(yùn)動(dòng)疲勞機(jī)制的重要內(nèi)容之一[1]，研究心肌缺血、過(guò)度訓(xùn)練可以通過(guò)降低抗氧化酶活性來(lái)提高心肌細(xì)胞的凋亡率[2,3]，Bcl-2、Bax作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因蛋白，其表達(dá)量在細(xì)胞凋亡中起著重要作用[4]。Zn-MT在生物體內(nèi)廣泛存在，是一種低分子量、能被金屬誘導(dǎo)且富含半胱氨酸的非酶類金屬結(jié)合蛋白[5]，如何將Zn-MT與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的研究結(jié)合起來(lái)是目前研究的一個(gè)重點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)動(dòng)大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練，研究Zn-MT對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟抗氧化酶活性以及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響并探討其可能機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠24只，體重250-280g，購(gòu)于陜西中醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，動(dòng)物室溫度25℃±5℃，相對(duì)濕度40%-70%，照明隨同自然變化。

1.2 動(dòng)物分組與訓(xùn)練方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)對(duì)照組（A）、補(bǔ)充Zn-MT+運(yùn)動(dòng)組（B），每組12只。大鼠自由飲食、攝水；B、C組以15m/min，15min/d運(yùn)動(dòng)量對(duì)動(dòng)物進(jìn)行為期3d的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練后，進(jìn)行正式的一次性力竭跑臺(tái)訓(xùn)練。具體訓(xùn)練方案按照表1進(jìn)行。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：大鼠在既定強(qiáng)度的訓(xùn)練時(shí)跟不上預(yù)定速度，運(yùn)動(dòng)遲緩、臀部壓跑道后壁，兩后肢失去主動(dòng)性運(yùn)動(dòng)后拖達(dá)30s，利用毛刷刺激驅(qū)趕時(shí)無(wú)明顯反應(yīng)；大鼠外在行為表現(xiàn)為呼吸急促、胸腹部起伏幅度大，外觀精神倦怠，俯臥位垂頭。大鼠訓(xùn)練方案見(jiàn)表1。

表1 訓(xùn)練小鼠運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目

1.3 取材及樣品制備

組織勻漿液制備：在最后一次運(yùn)動(dòng)力竭后斷頭處死，立即取出心臟，用濾紙吸干，稱取適量組織加入0.9%的生理鹽水，按W（g）：V（ml）=1:9的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（介質(zhì)配比：pH7.4的0.01mol/L Tris-HCL，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%的NaCl溶液）于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（以上全部操作在冰水浴中進(jìn)行）。然后根據(jù)劑盒說(shuō)明分別于低溫冷凍離心機(jī)1000 rpm/ min離心5min或3000-4000 rpm / min離心l 0min，分離上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前制?0%的勻漿液，離心（3500rpm，15min，0～4℃），取上清液在1～4℃的冰箱保存待測(cè)。

切片制備：將摘取的心臟在冰冷的生理鹽水中漂洗干凈，濾紙吸干水分并稱重。中性甲醛后固定，全自動(dòng)組織脫水機(jī)進(jìn)行脫水，全自動(dòng)組織包埋機(jī)包埋。置入4℃的4%多聚甲醛中固定，24 h后常規(guī)石蠟包埋明、切片（厚5μm）、脫蠟水化后待測(cè)。

1.4 凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分析

心肌組織的處理首先采用石蠟包埋，然后采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸末端標(biāo)記法（TUNEL）對(duì)細(xì)胞核中DNA3’-OH末端凋亡標(biāo)記，最后經(jīng)脫蠟、洗脫、孵育、和3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察[8]。通過(guò)對(duì)每張切片拍攝5個(gè)陽(yáng)性視野，再通過(guò)每個(gè)視野中的300個(gè)心肌細(xì)胞中計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，用平均數(shù)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比，從而觀察結(jié)果凋亡陽(yáng)性細(xì)胞分布情況。TUNEL購(gòu)自Roce公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.5 Bax、Bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)法檢測(cè)

制作心肌組織切片，使用3 %的雙氧水對(duì)內(nèi)源性酶進(jìn)行消除，然后再用微波抗原修復(fù)15min，隨后用1:5的小牛血清封閉抗原10min。在濕盒加入一抗后4℃下孵育過(guò)夜，然后再加入由生物素標(biāo)記的二抗。通過(guò)復(fù)溫，PBS沖洗后滴加二抗，再經(jīng)DAB顯色（黃），蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，用多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度測(cè)定。Bcl-2和Bax單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Zn-MT對(duì)力竭訓(xùn)練大鼠心肌細(xì)胞抗氧化酶活性的影響（見(jiàn)表2）

表2 鋅錳對(duì)訓(xùn)練小鼠心肌抗氧化酶活性的影響

注：*P<0.05

由表2可以看出，C組和B組相比，抗氧化酶活性均有不同程度的回升，其中GSH-Px和GSH有顯著性差異（P<0.05）。

2.2 Zn-MT對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（%）和Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)一覽表（見(jiàn)表3）

表3 鋅-MT對(duì)訓(xùn)練小鼠心肌細(xì)胞凋亡、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

注：*P<0.05，**P<0.01

由表3可以看出，B組和A組相比，細(xì)胞凋亡率下降但無(wú)顯著性差異，Bax表達(dá)下降且有極顯著性差異（P<0.01），Bcl-2表達(dá)上升有顯著性差異（P<0.05），Bax/Bcl-2比值也有顯著性下降（P<0.05）。

3 分析與討論

3.1 Zn-MT對(duì)大鼠心肌細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給運(yùn)動(dòng)大鼠補(bǔ)充Zn-MT后，心肌中GSH-Px、CAT、GSH、SOD酶活性升高，這是因?yàn)椋?）鋅感應(yīng)蛋白金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子1（MTF-1）和亮氨酸拉鏈蛋白上游刺激因子（USF）參與了氧化應(yīng)激對(duì)金屬硫蛋白的誘導(dǎo)[9]。而Zn-MT的啟動(dòng)子中包含金屬反應(yīng)元件（MRE），MRE需要MTF-1的激活，而MTF-1又需要鋅的參與。因此，抗氧化酶中的巰基可以結(jié)合Zn-MT中的游離新Zn離子，從而使氧化酶中的的巰基減弱氧化還原反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞膜的相對(duì)完整性[10]；（2）Zn-MT不穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)特性，在機(jī)體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)中會(huì)釋放出游離的鋅金屬離子，而鋅離子的高親和性可以競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷其他金屬的催化性氧化反應(yīng)，從而降低H2O2生成·OH的速率，另外，Zn還可以通過(guò)抑制鐵-氧-烯醇酸復(fù)合物的形成來(lái)防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的啟動(dòng)；（3）由于Zn-MT在體內(nèi)會(huì)釋放出Zn離子，與抗氧化酶中的巰基結(jié)合，防止因自由基的破壞而使Zn-MT中的金屬與巰基配位鍵斷裂，因此Zn-MT分子中巰基數(shù)目的多少會(huì)在很大程度上影響其對(duì)自由基的抵抗能力。因此可以推測(cè)Zn-MT提高心肌中GSH-Px、CAT、GSH、SOD的酶活主要是Zn-MT在機(jī)體反應(yīng)過(guò)程中釋放的Zn離子；（4）金屬硫蛋白中的Zn離子也可以通過(guò)抑制Fe離子參與氧化還原反應(yīng)，從而減少抗氧化酶的消耗，最終使抗氧化酶的總量增加和抗氧化能力的提高。

3.2 補(bǔ)充Zn-MT對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)表達(dá)量的影響

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）指為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。在機(jī)體各器官的組織細(xì)胞中，Bcl-2、Bax作為細(xì)胞凋亡調(diào)控的典型基因，其表達(dá)量與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。研究表明，Bcl-2在生物體內(nèi)過(guò)量表達(dá)時(shí)，會(huì)形成同源二聚體，同時(shí)通過(guò)改變線粒體對(duì)Ca2+攝取速率和總量，以及通過(guò)對(duì)線粒體通透性的調(diào)節(jié)而抑制細(xì)胞膜上脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，從而影響細(xì)胞凋亡的過(guò)程[11]。而當(dāng)Bax過(guò)量表達(dá)時(shí)，會(huì)以Bax同源二聚體的形式抑制Bcl-2的活性表達(dá)，從而使細(xì)胞凋亡的概率增加[12]。由于Bcl-2/Bax的比值與Bcl-2-Bax細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，因此若Bcl-2/Bax的比值升高會(huì)降低細(xì)胞的凋亡率；反之則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

心肌細(xì)胞屬于受植物性神經(jīng)支配的不隨意肌，具有興奮收縮的能力但不具備增值能力。心肌細(xì)胞凋亡與心臟正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的保持具有重要的作用，在心臟由生理性向病理性轉(zhuǎn)變的過(guò)程中起著基礎(chǔ)性作用，是心肌細(xì)胞發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)[13]。本實(shí)驗(yàn)從免疫組織化學(xué)水平檢測(cè)了Bax、Bcl-2在力竭訓(xùn)練后大鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)對(duì)照組心肌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率升高，Bax的表達(dá)主要表現(xiàn)為上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2的比值升高。提示在進(jìn)行大強(qiáng)度力竭性運(yùn)動(dòng)后心肌細(xì)胞可能出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)疲勞性微損傷，凋亡動(dòng)態(tài)失衡。這是因?yàn)樵诖髲?qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，心肌處于一過(guò)性缺血狀態(tài)，這對(duì)心肌是一種逆境。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生機(jī)制之一是由于自由基的大量生成而產(chǎn)生的凋亡誘導(dǎo)作用[14]。而超氧陰離子作為自由基的一種表現(xiàn)形式，可以使運(yùn)動(dòng)后心肌細(xì)胞的凋亡增加[15,16]。由于Bax/Bcl-2的比值更能客觀反映細(xì)胞凋亡的的情況，因此在本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組Bax/Bcl-2比值增加，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案訓(xùn)練可以增加心肌細(xì)胞Bax mRNA的表達(dá)量而減少Bcl-2 mRNA的表達(dá)量。

補(bǔ)充Zn-MT后，Bax表達(dá)下降，Bcl-2表達(dá)上升，Bax/Bcl-2比值也有顯著性下降，說(shuō)明心肌細(xì)胞的凋亡得到一定的緩解，這也說(shuō)明Zn-MT在抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著重要的緩沖作用。由于Zn-MT中含有鋅離子，而鋅是機(jī)體必需微量元素，具有促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞合成的生物學(xué)效應(yīng)。在Zn-MT與氧自由基發(fā)生拮抗反應(yīng)的同時(shí)，Zn2+可以游離出來(lái)，可以在一定程度上對(duì)組織進(jìn)行修復(fù)和減輕炎癥反應(yīng)，從而減緩由于力竭運(yùn)動(dòng)造成的心肌細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞凋亡。由此可以判定Zn-MT對(duì)心肌的保護(hù)作用可以使心肌免受自由基的損傷。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的過(guò)程，在降低氧化發(fā)生率的同時(shí)促進(jìn)抗氧化酶活力的升高，使細(xì)胞內(nèi)外的鈣穩(wěn)態(tài)保持穩(wěn)定，通過(guò)Bcl-2和Bax蛋白在心肌中的不同表達(dá)量影響心肌細(xì)胞的凋亡，從而維持心肌的正常功能。

4 結(jié) 論

大強(qiáng)度力竭性運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)微引起細(xì)胞凋亡速率的加劇。補(bǔ)充Zn-MT可以通過(guò)增加心肌細(xì)胞抗氧化酶活性和改變Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，減少力竭運(yùn)動(dòng)后的心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞受損。

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Effects of Zn-MT on the Expression of Antioxidant Enzymes and Apoptotic Proteins in Myocardium of Exercise Rats

LI Feng

Physical Education Department, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi' an Shaanxi, 710055, China.

Purpose: Probe into the influence of myocardium cell anti-oxidase, apoptosis、Bax、Bcl-2 about Zn-MT to exhaust mouse. Method：Choose 24 male SD big mice, assign to the sport control group（A）, supplementing Zn-MT+sport group（B）at random. B，C groups draw materials after strength exhaust sports，adopt the colorimetry to detect anti-oxidase，adopt TUNEL law to detect myocardium apoptosis、Bcl-2, adopt immune group law detect Bax albumen express. Result：In B Group, GSH-Px, CAT, GSH, SOD active decline, there is rising after supplementing Zn-MT, compared with group B, C group myocardium apoptosis and Bax protein express decrease obviously, Bcl-2 expresses increases. Conclusion: supplementing Zn-MT Can improve the myocardium anti-oxidase activity, reduce the myocardium cells after strength exhausts sports and apoptosis through influencing the myocardium.

Zinc-metallothionein; Anti-oxidase; Exhausted; Apoptosis; Bcl-2 albumen; Bax albumen

1007―6891（2020）03―0033―03

G804.7

A

2019-07-31

2019-09-03

2017年陜西省社會(huì)科學(xué)基金項(xiàng)目（2017R007），陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（17JK04180）。