LRH-1的小分子激活劑DLPC對牛卵巢顆粒細(xì)胞類固醇合成基因表達(dá)的影響

蔣小涵 , 徐德軍,李 曼，李青旺*，耿果霞

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

卵巢顆粒細(xì)胞(Granulosa cells, GCs)是卵泡當(dāng)中合成類固醇激素最重要的體細(xì)胞，類固醇激素對卵泡的生長發(fā)育以及調(diào)控卵母細(xì)胞成熟有重要作用[1]。STAR是類固醇激素合成的急速調(diào)節(jié)蛋白，對類固醇激素合成具有重要限速作用[2]，CYP17是雌激素合成的相關(guān)基因CYP17A1編碼細(xì)胞色素 P450-17α酶，是類固醇激素合成途徑中關(guān)鍵酶，CYP17為雌二醇合成的相關(guān)基因[2]。CYP11A1基因編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶，簡稱P450scc，是孕酮激素合成的關(guān)鍵酶，其催化膽固醇為孕烯醇酮，啟動(dòng)生物體內(nèi)類固醇激素合成的第一步[3]。

LRH-1(肝受體同系物1)又名NR5A2[4]，是核受體家族的成員，作為轉(zhuǎn)錄共激活子調(diào)控基因的表達(dá)[5]，LRH-1在排卵以及類固醇合成中都是必須的。雌性哺乳動(dòng)物中，LRH-1在卵巢中比在任何其他組織中更豐富，并且主要在GCs(原發(fā)性至排卵前卵泡)和卵巢CLs中表達(dá)[6-7]。研究者通過特異性LRH-1敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)LRH-1對胚胎發(fā)育[8]，卵泡成熟，卵泡類固醇合成和排卵[9]有重要作用。然而，LRH-1對GCs類固醇激素相關(guān)基因表達(dá)水平的作用仍然未知。因此，本試驗(yàn)利用免疫組化研究LRH-1在牛卵巢組織中的表達(dá)定位；并利用LRH-1特異性激活劑DLPC處理卵巢顆粒細(xì)胞，RT-qPCR檢測LRH-1激活對STAR、CYP17和CYP11等類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 卵巢的來源

本試驗(yàn)所用的樣品牛卵巢來源于陜西西安某屠宰場，采用商品化的2～4歲的秦川母牛為樣本，樣品選取大小為2～8 mm的中小卵泡，采集的牛卵巢置于滅菌的PBS(含10 IU/mL雙抗，37 ℃)中，處理后，移入無菌操作臺中。

1.2 主要試劑

DMEM/F12、Insulin、BSA、亞硒酸鈉、非必需氨基酸購買自Sigma，CCK-8增值凋亡試劑盒(Vazyme)，DLPC(美國APE&BIO生物公司)，Tirzol購自Takara，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑購自abm公司，F(xiàn)SH購自寧波第二激素廠，轉(zhuǎn)鐵蛋白購自Solaibao生物有限公司。

1.3 牛卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)

用注射器吸取中小卵泡，將400目的細(xì)胞篩網(wǎng)潤濕，過濾離心5 min。培養(yǎng)液重懸牛卵巢顆粒細(xì)胞，將沉淀收集在離心管中，加入完全培養(yǎng)基(3% BSA、50 ng/mL Insulin、0.1 IU/mL FSH、100×青鏈霉素雙抗、50 ng/mL亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白50 ng/mL、非必需氨基酸100×)懸浮細(xì)胞，采用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)法將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/mL，稀釋細(xì)胞，接種并放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃)。培養(yǎng)至48 h后收集生長至對數(shù)期的牛卵巢顆粒細(xì)胞[10]。

1.4 免疫熒光化學(xué)法

顆粒細(xì)胞中會(huì)表達(dá)有特異性的促卵泡激素受體(FSHR)，使用免疫熒光法鑒定分離培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞。所用卵泡激素受體FSHR購買于武漢博士德公司，4%多聚甲醛固定顆粒細(xì)胞。Triton X-100 (0.2%)反應(yīng)20 min，室溫滴加3% FBS封閉1 h，再加入稀釋好的FSHR，4 ℃過夜孵育，室溫滴加適量熒光標(biāo)記的二抗反應(yīng)1 h。DAPI反應(yīng)5 min，封片，鏡檢。

1.5 免疫組織化學(xué)法

將牛卵巢組織塊用4%的多聚甲醛4 ℃過夜浸泡。用PBS-Twen-20(PBST)沖洗。將組織切片放入修復(fù)盒中10～15 min。滴加3% BSA，室溫封閉1 h，滴加稀釋好的一抗，4 ℃過夜，同時(shí)用一抗來源動(dòng)物未免疫前的血清作為陰性對照；滴加適量一定濃度的二抗，室溫孵育30 min；滴加適量DAB溶液，之后滴加適量蘇木素復(fù)染1.5～2 min，脫水。中性樹膠封片，鏡檢[11]。

1.6 顆粒細(xì)胞總RNA提取以及實(shí)時(shí)定量PCR

Trizol方法提取顆粒細(xì)胞總RNA[13]，用abm的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物(如表1)設(shè)計(jì)全部在NCBI網(wǎng)站上完成，GAPDH作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCT法分析RT-qPCR結(jié)果。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛卵巢顆粒細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)初期呈圓形，培養(yǎng)24 h貼壁，培養(yǎng)24～48 h時(shí)，顆粒細(xì)胞增長迅速，待顆粒細(xì)胞增長密度>70%時(shí)，細(xì)胞顏色透亮，形態(tài)良好，細(xì)胞團(tuán)增長明顯，方可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(如圖1)。

2.2 牛卵巢顆粒細(xì)胞鑒定

由于顆粒細(xì)胞特異性表達(dá)FSHR蛋白，紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞，為表達(dá)FSHR陽性的細(xì)胞(圖2)，藍(lán)色熒光區(qū)域?yàn)镈API。通過標(biāo)記FSHR以及細(xì)胞核，可以直觀地看出顆粒細(xì)胞的分布及表達(dá)FSHR的牛卵巢顆粒細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)可得，表達(dá)FSHR的牛卵巢顆粒細(xì)胞陽性率>95.5%，試驗(yàn)結(jié)果說明經(jīng)過分離培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞純度達(dá)到95.5%，為下一步牛卵巢顆粒細(xì)胞試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖1 體外培養(yǎng)牛卵巢顆粒細(xì)胞24 h(10×)

圖2 牛卵巢顆粒細(xì)胞免疫熒光鑒定

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測LRH-1在牛卵巢組織中的表達(dá)定位

棕色為表達(dá)LRH-1的牛卵巢顆粒細(xì)胞(如圖3B)，藍(lán)色部分為未表達(dá)LRH-1的細(xì)胞(如圖3A)，試驗(yàn)結(jié)果表明LRH-1在顆粒細(xì)胞中高度表達(dá)，在其他細(xì)胞中表達(dá)不高。

圖3 牛卵巢免疫組織化學(xué)

2.4 LRH-1對牛顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)的影響

不同濃度(20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、200 μM)的DLPC處理牛卵巢顆粒細(xì)胞。與對照組相比，50 μM DLPC顯著促進(jìn)STAR、LRH-1、CYP17基因的mRNA表達(dá)(P<0.05,圖4)，50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM的DLPC顯著抑制了CYP11基因的表達(dá)量(P<0.05)。結(jié)果表明LRH-1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了雌激素合成酶CYP17基因的表達(dá)，抑制了孕酮合成限速酶CYP11基因的表達(dá)。

圖4 不同濃度(20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、200 μM)的DLPC對STAR、CYP11、LRH-1的基因表達(dá)的影響

3 討 論

LRH-1基因編碼的蛋白質(zhì)是DNA的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，也是孤核受體家族成員。LRH-1調(diào)節(jié)膽固醇機(jī)制、類固醇生成、細(xì)胞增殖和干細(xì)胞多能性。卵巢特異性敲除SF-1會(huì)破壞卵泡發(fā)育，而LRH-1特異性敲除可阻礙卵泡排卵、卵丘擴(kuò)張和黃體化。LRH-1孤核受體是生殖組織的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。LRH-1編碼的蛋白質(zhì)參與乙型肝炎病毒和膽固醇生物合成的基因表達(dá)，LRH-1可能是胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。

選擇適宜的培養(yǎng)基可以影響細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞衰老的時(shí)間，本試驗(yàn)建立了牛卵巢顆粒細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系，克服了細(xì)胞自發(fā)黃體化，并利用該系統(tǒng)研究了類固醇的合成及細(xì)胞的增殖凋亡等一系列生理反應(yīng)。有研究表明，使用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，可能使細(xì)胞處于發(fā)育或閉鎖的不同階段，其中血清可能會(huì)抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞分裂[14]，所以有必要開發(fā)牛卵巢顆粒細(xì)胞體外無血清培養(yǎng)體系，以便研究顆粒細(xì)胞對卵泡的調(diào)控機(jī)制。

類固醇激素對維持雌性動(dòng)物的生殖生理有至關(guān)重要的作用[15]。Manna等[16]發(fā)現(xiàn)，類固醇的合成對卵泡閉鎖有至關(guān)重要的作用；Mendelson等[17]報(bào)道了LRH-1基因敲除的小鼠胚胎未能形成原腸胚，LRH-1在成年人的胃腸道、肝臟、胰腺及卵巢中表達(dá)，它調(diào)節(jié)類固醇生成。但LRH-1在牛卵巢顆粒細(xì)胞參與類固醇激素的調(diào)控機(jī)制的研究闡明較少。Sirianni等[18]研究表明，線粒體中CYP11A1產(chǎn)生的孕烯酮可以被CYP17羥基孕烯酮所代替，也可以被HSD3β2代替。Hohenester[19]報(bào)道添加激活劑DLPC會(huì)特異性地結(jié)合LRH-1的配體結(jié)合域，體外培養(yǎng)條件下，DLPC可以有效地激活人與小鼠LRH-1的表達(dá)，而不影響其它核受體表達(dá)，DLPC可能成為一種治療代謝性疾病的藥物[20]。本試驗(yàn)采用RT-qPCR法檢測LRH-1的mRNA基因表達(dá)，50 μM DLPC顯著提高LRH-1基因表達(dá)(P<0.05)，與Lee等[20]報(bào)道一致。Sirianni[18]進(jìn)一步研究表明，LRH-1與SF-1在大多數(shù)類固醇合成組織中表達(dá)，調(diào)節(jié)多種類固醇代謝酶的表達(dá)，LRH-1可以促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與類固醇激素生成的限速步驟和反應(yīng)，50 μM DLPC顯著提高STAR基因的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但20 μM DLPC抑制CYP11A1的表達(dá)，可能是LRH-1的小分子激活劑DLPC抑制CYP11A1的表達(dá)進(jìn)而抑制孕酮激素的分泌。Sidler等[21]研究表明LRH-1在CRC細(xì)胞系中過表達(dá)，促進(jìn)了類固醇生成酶CYP11A1和CYP11B1的表達(dá)，同時(shí)增加了免疫調(diào)節(jié)皮質(zhì)類固醇的水平。本試驗(yàn)添加50 μM的DLPC，顯著提高STAR、CYP11A1的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

4 結(jié) 論

LRH-1在牛卵巢顆粒細(xì)胞中高度表達(dá)，50 μM DLPC可顯著提高牛卵巢顆粒細(xì)胞LRH-1、STAR、CYP17基因的表達(dá)，20 μM DLPC可顯著抑制牛卵巢顆粒細(xì)胞孕酮合成相關(guān)CYP11基因的表達(dá)。