南嶺山地南方紅豆杉天然林與人工干擾群體的遺傳變異分析

（中南林業(yè)科技大學 風景園林學院，湖南 長沙 410004）

南方紅豆杉Taxus chinensisvar.mairei是紅豆杉科Taxaceae 紅豆杉屬Taxus一個變種[1]，是紅豆杉屬在我國分布最廣泛、資源量較大的種[2]。20世紀70年代以來，紫杉醇的發(fā)現(xiàn)是醫(yī)藥界的福音，但也給我國紅豆杉天然資源帶來了巨大災難。大量南方紅豆杉天然資源被砍伐，生境遭到了嚴重破壞，種群數(shù)量迅速減少[3]。1999年，我國政府將紅豆杉列為國家Ⅰ級保護樹種，但至今，紅豆杉盜伐現(xiàn)象時有發(fā)生。目前，南方紅豆杉天然群體僅在偏遠山區(qū)或自然保護區(qū)有少量間斷分布[4]，其遺傳多樣性保護也引起了眾多學者的關(guān)注和重視[5-6]。

南嶺山脈是我國南部地區(qū)重要的自然地理分界線，橫跨湖南、江西、廣東、廣西四個省區(qū)，其獨特的地理位置及多樣復雜的環(huán)境給動植物生存繁衍提供了良好條件，是我國生物多樣性中心關(guān)鍵地區(qū)之一[7]，也是我國裸子植物多樣性中心之一[8]。南嶺是我國建立自然保護區(qū)最多的地區(qū)之一，南方紅豆杉在南嶺地區(qū)得到了很好的保存及繁衍，其中不僅有少量間斷分布的天然林群體，還保存有較多的村落古樹林、風水林、保護地遷地林等人工或半人工干擾群體[8]。南嶺地區(qū)豐富的紅豆杉群體資源是研究群體遺傳變異的良好材料，也是研究不同干擾程度對群體遺傳變異影響的理想材料。植物葉綠體基因組相比較于核基因組而言，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、序列保守、進化速率緩慢、單親遺傳、幾乎不發(fā)生重組等特點[9-10]。而葉綠體DNA 非編碼區(qū)核苷酸替換速率相對較高，可以提供更多的變異位點。因此，葉綠體非編碼區(qū)測序被廣泛應用于物種的遺傳多樣性、譜系地理學和系統(tǒng)發(fā)育學研究[11]。本研究利用4 個葉綠體非編碼區(qū)序列檢測南嶺山地8 個南方紅豆杉群體（天然林和人工干擾群體各4 個）的遺傳變異，通過天然林群體和人工干擾群體遺傳多樣性比較分析，揭示人類活動對植物群體遺傳變異的影響，為制定南嶺地區(qū)南方紅豆杉遺傳保護策略提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究樣本來源于南嶺地區(qū)8 個南方紅豆杉群體，包括天然群體和人工干擾群體各4 個（表1），共64 個單株。4 個紅豆杉天然群體分別為廣東乳源自然保護區(qū)核心區(qū)、廣西花坪自然保護區(qū)核心區(qū)、湖南黃桑自然保護區(qū)核心區(qū)和湖南桂東自然保護區(qū)核心區(qū)。4 個紅豆杉人工干擾群體分別為廣東南雄村落風水林、湖南綏寧村落風水林、湖南新寧林場人工林和湖南舜皇山種質(zhì)資源苗圃。采集新鮮、無病蟲害的嫩葉適量，硅膠干燥，于-20 ℃下 保存，用于DNA 提取。

表1 南方紅豆杉采樣群體信息Table 1 The information of sampling populations of Taxus chinensis var.mairei

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取

采用改良CTAB 法[12]提取南方紅豆杉葉片

DNA。

1.2.2 PCR 擴增與測序

從植物葉綠體數(shù)據(jù)庫中選取4 個非編碼區(qū)cpDNA 通用引物（見表2）檢測序列變異情況[13]。PCR 反應體系包含1×Multiplex PCR master 混合液、0.20 μM 的正向和反向引物混合液和10 ng DNA 模板。PCR 反應條件如下：95 ℃預變性 15 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán)；60 ℃延伸30 min。PCR產(chǎn)物按照BigDye? Terminator v.3.1 測序試劑盒（Applied Biosystems）方法進行，乙醇純化后在ABI3100 測序儀（Applied Biosystems）上機測序。

表2 4 個葉綠體非編碼區(qū)片段引物信息Table 2 The primer of four chloroplast non-coding fragments (Heinze 2007)

1.3 序列比對與數(shù)據(jù)分析

使用Sequencher 4.10（http://www.genecodes.com/）組裝每個位點的正向和反向核苷酸序列。采用MEGA 5.05 軟件[14]進行序列比對，統(tǒng)計序列間堿基突變位點、簡約信息位點等。利用DNAsp 6.0[15]軟件計算單倍型數(shù)量(Ha)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(K)。Arlequin 3.1 軟件[16]進行分子方差分析（AMOVA），計算種群間和種群內(nèi)或組間與組內(nèi)的遺傳差異；采用PERMUT 2.0[17]軟件計算總的基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)遺傳多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)GST和NST，并采用1 000 次置換試驗進行檢驗。MEGA 5.05[12]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Network 5.0[18]軟件進行單倍型網(wǎng)絡圖構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體序列變異分析

采用4 個葉綠體非編碼區(qū)片段（表2）對南方紅豆杉64 個樣本進行檢測。4 個片段矯正合并后全長為2 608 bp，插入缺失（indel）13 bp，G+C含量約為32.9%，共發(fā)現(xiàn)3 個變異位點，其中簡約性信息位點2 個，分別發(fā)生在1 252 bp 和2 337 bp處。所有樣本共檢測到4 個單倍型，將其編號為H1、H2、H3和H4（表3）。4個單倍型（H1,H2,H3,H4）在不同群體中的分布存在差異，單倍型H1 分布最廣泛，在8 個群體中均有分布。其次是單倍型H2，除Gdnx 群體外，其均有分布。人工干擾群體檢測到兩個單倍型（H1、H2），天然群體除了單倍型H1 和H2 以外，還檢測出兩個特有單倍型H3(Gxhp)和H4(Hngd)（圖1）。

表3 南方紅豆杉4 個單倍型序列變異位點Table 3 Four haplotype sequence variants of Taxus chinensis var.mairei

2.2 種的水平的遺傳變異

2.2.1 遺傳多樣性

利用DNAsp 6.0 軟件分析8 個南方紅豆杉群體遺傳多樣性，8 個群體之間的多態(tài)性表現(xiàn)不同（表4）。Gxhp 群體和Hngd 群體具有的單倍型數(shù)量最多，遺傳多樣性水平也最高，Gdnx 群體僅具有一個單倍型，因此遺傳多樣性水平最低。8 個群體總的單倍型多樣性(Hd)為0.552，核苷酸多態(tài)性(Pi)為0.000 23，平均核苷酸差異數(shù)(K)為0.599。

2.2.2 遺傳分化

通過PERMUT 2.0 軟件分析，南方紅豆杉群體的總的基因多樣性(Ht)為0.562，群體內(nèi)遺傳樣性(Hs)為0.473?；蚍只禂?shù)NST(0.190)大于GST(0.158)（P＜0.01），表明南方紅豆杉群體存在顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)。AMOVA 分析結(jié)果（表5）表明，大部分遺傳變異來源于群體內(nèi)，占總遺傳變異的82.55%，群體間變異占總遺傳變異的12.85%，群體間遺傳分化極顯著（FSt= 0.175，P＜0.001）。

圖1 南方紅豆杉群體單倍型的分布與頻率Fig.1 Haplotype distribution and frequency of Taxus chinensis var.mairei populations

表4 8 個南方紅豆杉群體遺傳多樣性參數(shù)對比分析?Table 4 Comparison of genetic diversity of eight Taxus chinensis var.mairei populations

2.2.3 單倍型系統(tǒng)發(fā)育及網(wǎng)絡圖分析

基于MEGA 軟件的鄰接法（NJ）構(gòu)建南方紅豆杉4 種單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果顯示，4 個單倍型主要分為兩個分支，單倍型H2和H3 親緣關(guān)系較近，聚為一個小分支，再和H1聚為一個大分支，而單倍型H4 單獨為一個分支。

通過軟件Network 5.0 軟件構(gòu)建南方紅豆杉不同群體單倍型之間的中介-鄰接網(wǎng)絡圖（Medianjoining,MJ）（圖2），結(jié)果顯示，單倍型H2 位于中心位置，分布數(shù)量最多，頻率最高的是H1，而H3 和H4 是兩個天然林特有單倍型，僅存在一個群體，頻率較低。

2.3 天然林與人工干擾群體的遺傳變異比較

為了探究南嶺山地天然林和人工干擾林遺傳變異特性及遺傳分化，比較其遺傳多樣性及遺傳分化程度。葉綠體非編碼區(qū)測序結(jié)果顯示，4 個天然群體的單倍型數(shù)量(Ha)為4，單倍型多樣性(Hd)為0.603，核苷酸多樣性(Pi)為0.000 27；人工干擾群體的單倍型數(shù)量(Ha)為2，單倍型多樣性(Hd)為0.508，核苷酸多樣性(Pi)為0.000 20，天然群體遺傳多樣性高于人工干擾群體（表4）。AMOVA 結(jié)果顯示，天然林和人工干擾林兩組群間存在明顯的遺傳變異（FCT=0.046＜0.05，P＜0.001）（表5）。

表5 南方紅豆杉群體分子方差分析結(jié)果Table 5 Results of AMOVA in populations of Taxus chinensis var.mairei

圖2 4 種單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹及單倍型網(wǎng)絡圖（圓圈的大小與單倍型的相對頻率呈正比）Fig.2 The phylogenetic tree of four haplotypes and the network for haplotypes (Size of the circle is proportional to the relative frequency of a haplotype)

3 討 論

3.1 南嶺山地南方紅豆杉群體遺傳變異模式

本研究對64 個南方紅豆杉的4 個葉綠體非編碼區(qū)DNA 片段進行測序，共檢測出4 個單倍型，單倍型H1 在所有種群中均有分布，且在大多數(shù)群體中占有數(shù)量優(yōu)勢。單倍型H2 在網(wǎng)絡圖中位于中心位置，說明單倍型H2 是較為古老的單倍型。而單倍型H4 僅在天然群體Hngd 中存在，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中單獨聚為一支，這可能與Hngd 群體特殊的高海拔的地理位置有關(guān)。單倍型H3 只存在于天然群體（Gxhp）中且只有一個樣本，其可能與葉綠體非編碼區(qū)序列出現(xiàn)種內(nèi)變異有關(guān)。

基于葉綠體非編碼區(qū)序列獲得的南方紅豆杉總的遺傳多樣結(jié)果表明，群體總的單倍型多樣性Hd=0.552，核苷酸多態(tài)性Pi=0.000 23，總的基因多樣性Ht=0.562，和其他裸子植物相比，南方紅豆杉遺傳多樣性處于中等水平，低于祁連圓柏Juniperus przewalskii[19]（Ht=0.57）和華南五針松Pinus kwangtungensis[20]（Ht=0.63），但高于青海云杉Pinus crassifolia[19]（Ht=0.27）?；蚍只禂?shù)NST=0.190 大于GST=0.158（P＜0.01），說明南方紅豆杉群體存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。AMOVA 分析結(jié)果表明，南嶺地區(qū)南方紅豆杉群體主要的遺傳變異來自于群體內(nèi)（82.55%）。FST的值為0.175＞0.15 且P值小于0.01，說明南方紅豆杉群體間遺傳分化程度高，這可能是由于南方紅豆杉是雌雄異株，異交植物，通常種植于常綠闊葉林中，與針葉樹種混種，限制了花粉的傳播，不利于群體間基因交流，很大程度上增加了群體間的遺傳分化。此外，南方紅豆杉群體在南嶺山脈地區(qū)呈片斷化分布，南嶺山脈地勢復雜，形成了豐富的局部小氣候[5]，群體間形成高山阻隔，加劇了群體間的遺傳分化。

3.2 人類活動（干擾）對植物群體遺傳變異的影響

南嶺山地南方紅豆杉天然林和人工干擾群體遺傳多樣性的比較結(jié)果顯示，天然群體的遺傳多樣性（Hd=0.603，Pi=0.000 27）高于人工干擾群體（Hd=0.508，Pi=0.000 20），這與李乃偉等[5]利用ISSR 標記比較南方紅豆杉野生種群和遷地保護種群的遺傳多樣性結(jié)果一致。而此現(xiàn)象在水松Glyptostrobus pensilis[21]、云杉Picea asperata[22]、水杉Metasequoia glyptostroboides[23]等樹種的研究中也有發(fā)現(xiàn)。前人的研究結(jié)果表明，南方紅豆杉瀕危與遺傳多樣性并無顯著關(guān)系，其對環(huán)境變化的適應能力較強，人為干擾與其生殖特性可能是造成瀕危的主要原因[24]，因此，本研究中南方紅豆杉天然群體遺傳多樣性高于人工干擾群體的原因可能是由于人工干擾群體位于離人群較近的地方，人為干擾程度較高，導致人工干擾群體遺傳多樣性低于天然群體。

3.3 南方紅豆杉遺傳資源保護策略

運用分子標記技術(shù)探究瀕危或保護植物的遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)與變異規(guī)律，對該物種的有效保護具有重要意義[25]。南方紅豆杉樹形優(yōu)美，材質(zhì)優(yōu)良，其含有的紫杉醇是目前臨床上使用最廣泛的天然抗癌藥物之一，20世紀60年代初人們對紅豆杉的過度砍伐，導致紅豆杉群體數(shù)量急劇減少。本研究結(jié)果表明，天然群體遺傳多樣性較高，建議對所有現(xiàn)存的南方紅豆杉群體就地保護，建立自然保護區(qū)，盡量減少人為干擾。對于具有獨特單倍型的天然群體（Gxhp 和Hngd）應給予最高級別的保護，同時加強天然群體中幼苗的撫育管理，促進天然群體自然更新。此外，人工干擾群體也是其資源的重要組成部分，因此，也應該采取一定的保護措施，例如對當?shù)卮迕襁M行宣傳教育，立標識牌等。另一方面，由于南方紅豆杉遺傳分化程度高，因此在進行遷地保護時，應盡可能的保存不同種源的南方紅豆杉，避免遺傳多樣性的喪失，同時輔以扦插和嫁接等栽培管理措施，加快紅豆杉的繁殖，擴大種群數(shù)量。

4 結(jié) 論

本研究表明，南嶺山地南方紅豆杉群體間具有中度的遺傳多樣性且遺傳分化程度高，其可能與有限的基因流、近親繁殖和人為干擾等因素的綜合影響有關(guān)。根據(jù)葉綠體非編碼區(qū)序列變異分析結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)4 個單倍型，其中存在兩個私有單倍型，產(chǎn)生私有單倍型的原因可能是由于群體特殊的地理環(huán)境和種內(nèi)變異。天然林群體的遺傳多樣性高于人工干擾群體但相差不大，且南方紅豆杉群體間遺傳分化大，說明南方紅豆杉人工干擾群體資源也十分重要。本研究結(jié)果可為南方紅豆杉群體遺傳學以及南嶺地區(qū)南方紅豆杉遺傳資源保護策略的制定提供科學依據(jù)。