原發(fā)性高血壓相關的線粒體tRNA突變研究

余雪姣 金菊仙 董全勝 陳秀花

原發(fā)性高血壓（Essential hypertension，EH）是一種原因不明、以動脈血壓升高為主要臨床表現(xiàn)的復雜性疾病，是嚴重的公共健康問題。高血壓中90%為EH［1］，EH是一種由多因素引發(fā)的復雜性疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明。有研究表明，高血壓是一種多基因、多因素、復雜異質性的疾病，線粒體在調節(jié)血管的各個方面起到關鍵的作用［2-3］。線粒體tRNA基因突變是與疾病相關的突變熱點區(qū)域，已報道的與EH相關的線粒體tRNA突變有tRNAMet/tRNAGlnA4401G［4］、tRNAThr G15927A突變［5］等。為了更好的理解線粒體tRNA突變和EH的相關性，作者開展了EH患者線粒體tRNA突變篩選，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年1月在衢州市人民醫(yī)院心內(nèi)科門診和住院的EH患者共200例，其中男150例，女50例；年齡25～70歲，平均47.5歲。納入標準：EH的診斷符合《中國高血壓防治指南2010》推薦的標準［6］。排除標準：繼發(fā)性高血壓、白大衣性高血壓、糖尿病、甲狀腺疾病、嚴重的肝腎功能損害、嚴重心律失常、惡性腫瘤、感染等疾病。此外，選取100例年齡和性別相仿的健康體檢人群作為正常對照，其中男70例，女30例；年齡18～66歲，平均40.5歲。

1.2 基因組DNA提取 抽取受試者及正常對照個體外周靜脈血2ml于EDTA-K2中，按照Universal Genomic DNA提取試劑盒（TakaRa 4.0）的使用說明提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 線粒體tRNA基因組全序列分析 本研究以提取的全基因組DNA為模板進行線粒體tRNA基因組的擴增，所需引物參考前期發(fā)表的文獻［7］。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用BigDye末端循環(huán)測序反應試劑盒在ABI 3700全自動DNA測序儀上進行測序。測序結果使用DNA Star軟件與修正的人類線粒體DNA劍橋參考序列比對［8］。同時，對100例正常對照個體進行線粒體tRNA基因組擴增、測序分析，方法同上。

1.4 種系進化保守分析 通過Clustal X 軟件將人類線粒體基因的變異位點與16種哺乳類動物的線粒體基因相應位點進行保守性分析，得出保守性指數(shù)（Conservation index，CI），分析這些變異位點在種系發(fā)育過程中所起的作用，其中CI＞75%被認為有功能學意義［9］。

1.5 線粒體tRNA致病性突變評估 由于線粒體tRNA的高突變率，有研究表明：大部分tRNA變異位點屬于多態(tài)性［10］，因此鑒定致病性的tRNA突變尤為重要。本研究參考以下標準區(qū)分致病性tRNA突變：（1）在正常人群中的頻率＜1%；（2）CI＞75%；（3）突變是否影響tRNA結構或者引起功能學的改變［11］。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件。組間兩兩比較使用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 線粒體tRNA突變分析 利用PCR-Sanger測序法，對200例EH患者和100例正常對照個體進行了線粒體tRNA基因組的擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后測序分析，共鑒定了3個線粒體tRNA突變可能與EH有關：線 粒 體tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G，而這些突變位點在正常對照個體中均未發(fā)現(xiàn)。共發(fā)現(xiàn)5例患者攜帶線粒體tRNA突變，其中2例EH患者攜帶A4435G突變，突變頻率為1%；2例EH患者攜帶T4363C突變，突變頻率為1%；1例患者攜帶A8343G突變，突變頻率為0.5%。這些突變所對應的線粒體tRNA二級結構示意圖如圖1所示。

圖1 EH相關的mt-tRNA突變二級結構示意圖

2.2 攜帶線粒體tRNA突變的個體臨床和遺傳學分析 5例攜帶tRNA突變的患者中，男2例，女3例，發(fā)病年齡52～60歲。2例攜帶A4435G突變的EH患者中，女2例，無EH的家族史。2例攜帶T4363C突變的EH患者，男1例，女1例，均無EH的家族史。1例攜帶A8343G突變的EH患者為男性，無家族史。經(jīng)t檢驗，200例EH患者和100例正常對照個體，對其線粒體tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G突變比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 線粒體tRNA突變致病性評估 根據(jù)致病性的mt-tRNA突變評估方法，作者認為：線粒體tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G屬于致病性突變，可能與EH有關（見表1）。

表1 EH相關的線粒體tRNA變異位點分析

3 討論

本研究對EH相關的線粒體tRNA突變的篩查，經(jīng)過PCR擴增，基因測序比對后共發(fā)現(xiàn)3個可能與EH有關的突變位點：tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G。從結構上來看，A4435G突變位于tRNAMet的第37位點，與反密碼子毗鄰，該位點在進化上高度保守［12］。與其他位點相比，第37位點更易被修飾，修飾后的該位點在反密碼子識別的高保真度和維持tRNA三級結構及生化功能的穩(wěn)定性方面均起重要的作用［13］。前期研究表明：攜帶A4435G突變的個體線粒體tRNAMet的穩(wěn)定性下降了約40%，由此而造成的線粒體蛋白翻譯水平也下降了約50%，引起ATP合成減少，ROS 水平明顯增高［14］。

T4363C突變位于tRNAGln二級結構反密碼子環(huán)的38號位點，線粒體tRNAGln為重鏈編碼tRNA，其在16種靈長類及鼠、牛和爪蟾等物種中是高度保守的。Wong等［15］在一例發(fā)育遲緩、胃腸反流、視網(wǎng)膜炎發(fā)育不良和感音神經(jīng)性耳聾女性兒童患者中發(fā)現(xiàn)了此突變，并證實T4363C是一個同質性突變。二級結構預測中上述致病性突變通過與相對應的32位形成W-C堿基配對，延長反密碼子莖縮小反密碼子環(huán)，破壞tRNA合成酶識別和密碼子的配對，造成tRNA功能障礙，降低線粒體蛋白合成率引起線粒體功能障礙，引起疾病產(chǎn)生。T4363C突變可能對反密碼子識別的高保真性產(chǎn)生影響，從而參與疾病的發(fā)生［16］。

A8343G突變位于tRNALys基因的T環(huán)上，對tRNALys的穩(wěn)定性起著重要的作用。該突變可能導致tRNA代謝下降，影響tRNA的翻譯進而影響蛋白穩(wěn)定合成。此外，A8343G突變可能降低tRNA-氨基?；c延長因子Tu（EF-Tu）結合效率，從而影響tRNA的修飾［17］。此外，A8343G突變還參與了線粒體內(nèi)膜ATP-敏感鉀通道的合成，從而影響其活性及線粒體K+的傳送［18］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)線粒體tRNA突變可能與EH有關，A4435G、T4363C和A8343G突變會導致線粒體tRNA代謝障礙，引起蛋白合成受阻，最終造成線粒體功能損傷，進而參與了EH的發(fā)生發(fā)展。本研究的缺陷是標本量較少，后續(xù)的工作還要擴大樣本量。