NLRP3炎性小體基因多態(tài)性與慢性牙周炎易感性的相關(guān)性研究

陳幸 丁成 傅淑蕾 張鵬濤 張遠(yuǎn) 鐘良軍

牙周炎是由菌斑微生物引起的一種慢性感染性疾病，影響世界上約20%～50%的人口［1］。該病是由細(xì)菌入侵牙周組織，激活宿主免疫炎癥反應(yīng)和持續(xù)的免疫反應(yīng)不平衡，導(dǎo)致漸進(jìn)性牙周組織損傷［2］。研究表明，遺傳因素在決定宿主的免疫反應(yīng)方面可能起一定的作用［3］，此外，吸煙、性別以及糖尿病和冠心病等全身系統(tǒng)性疾病也會(huì)造成疾病易感性的個(gè)體差異。NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域亞成員，被證明參與慢性感染炎癥性疾病的先天免疫反應(yīng)［4］。在牙周炎患者中觀察到牙齦組織中NLRP3的過(guò)表達(dá)和唾液水平NLRP3的增加［5］?；谝种芅LRP3炎性小體的治療方法在實(shí)驗(yàn)性糖尿病牙周炎的治療中也取得了顯著的療效［6］。一項(xiàng)基于哥倫比亞人群的研究表明，NLRP3（rs4612666）基因型與老齡和吸煙習(xí)慣的協(xié)同作用可能影響慢性牙周炎（Chronic Periodontitis，CP）的發(fā)?。?］。但不同種族群體牙周炎的遺傳易感性存在差異，而目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)該基因座位的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與牙周炎易感性相關(guān)性研究的報(bào)道。因此，本研究擬探索NLRP3（rs4612666）基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)人群CP發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年12月至2018年12月本院牙周病診療中心就診的236例中重度CP患者（病例組，CP組），根據(jù)美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)（AAP，1999）的牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，使用牙周刻度探針（Hu-Friedy，UNC-15）分別在每顆牙齒頰舌面的遠(yuǎn)中、中央、近中進(jìn)行測(cè)量，并沿著牙周袋底提插式行走，記錄的臨床參數(shù)包括：牙周探診深度（Periodontal Probing Depth，PD）、臨床附著喪失（Clinical Attachment Loss，CAL）和全口探診出血指數(shù)（Full-Mouth Bleeding Score，F(xiàn)MBS）。中 度 CP為 PD 5～6mm，CAL 3～4mm；重 度 CP為PD≥7mm，CAL≥5mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：吸煙者或戒煙時(shí)間＜10年者；糖尿病、風(fēng)濕病等全身系統(tǒng)性疾病者；近1年內(nèi)有牙周治療史者；錯(cuò)頜畸形者；孕婦或哺乳期者。對(duì)照組通過(guò)多階段隨機(jī)抽樣方法從本院體檢中心抽取患有局部牙齦炎或牙周健康的對(duì)照，并且按年齡、性別與病例組進(jìn)行匹配。所有對(duì)照組經(jīng)過(guò)牙周檢查無(wú)PD≥4mm的牙周袋且FMBS＜20%。本研究得到了杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 樣本收集 所有觀察對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，均抽取前臂外周血5ml保存于EDTA抗凝管中。在-20℃下放置過(guò)夜后保存于-80℃冰箱，留待提取DNA。

1.3 DNA提取和基因分型 采用DNA提取試劑盒 提 取 DNA（TIANGEN，TIANamp Geomic DNA Kit）。使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 方 法 對(duì) NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性進(jìn)行基因分型。引物序列為上 游：5'-TGCTTAAGGCCATTAATTGTG-3'， 下 游5'-CTCCACCATGGACAAGGAAG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為260bp。PCR反應(yīng)體系：混合物總反應(yīng)體積為15μl，包含1μl DNA、上下游引物各 0.5μl、DreamTaq Green PCR Master Mix（2X）（Thermo Fisher）8μl和 5μl滅菌雙蒸水。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察條帶。PCR和酶切反應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照項(xiàng)，基因多態(tài)性的分型檢測(cè)均在盲法原則下完成，并隨機(jī)抽取10%樣本進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試2次，驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SNP Stats軟件用于評(píng)估哈迪溫-伯格平衡（Hardy-Weiberg，HWE，P＞0.05）。使用SPSS 25.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。NLRP3 rs4612666位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率的分布比較計(jì)算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（95% CI），當(dāng)可信區(qū)間不包括1.0時(shí)存在相關(guān)性，采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CP組和正常對(duì)照組（HC組）臨床資料比較 見(jiàn)表1。

表1 CP組和HC組臨床資料比較（）

表1 CP組和HC組臨床資料比較（）

CP組（n=236） HC組（n=191） P值性別（n） 男性 107 101 0.12女性 129 90 -年齡（歲） 均數(shù) 48.31±9.65 46.57±8.59 0.53范圍 33～65 31～62 -探診深度（mm） 4.36±0.52 2.37±0.31 ＜0.001臨床附著喪失（mm） 4.92±0.78 2.51±0.25 ＜0.001程度（n） 中度CP 85 - -重度CP 151 - -

2.2 NLRP3基因rs4612666位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布 CP組和HC組的NLRP3（rs4612666）最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）和基因型分布見(jiàn)表2。經(jīng)HWE檢驗(yàn)，基因型和等位基因分布頻率符合HWE（χ2=2.87，P=0.09）。二次隨機(jī)選擇的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果與對(duì)應(yīng)原始結(jié)果比較的符合率為100%。根據(jù)性別和CP嚴(yán)重程度分組的rs4612666位點(diǎn)的基因型分布情況見(jiàn)圖1。

表2 NLRP3（rs4612666）C/T基因型分布及最小等位基因頻率［n（%）］

圖1 rs4612666位點(diǎn)的基因型分布情況。A：NLRP3（rs4612666）位點(diǎn)各基因型在中度和重度慢性牙周炎患者中的分布；B：NLRP3（rs4612666）位點(diǎn)各基因型在男性和女性慢性牙周炎患者中的分布

2.3 NLRP3基因rs4612666位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布比較 所有CP患者和對(duì)照組之間進(jìn)行各基因型和等位基因的頻率對(duì)比分析，表3顯示NLRP3 rs4612666位點(diǎn)攜帶T等位基因的人群，患CP的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（CT vs. CC：OR=2.09，95% CI=1.09～4.03，P=0.026；TT vs. CC ：OR=2.86，95% CI=1.24～6.59，P=0.013；CT/TT vs. CC：OR=2.27，95% CI=1.21～4.25，P=0.010；T等位基因 vs. C等位基因：OR=1.50，95%CI=1.14～1.97，P=0.003）。當(dāng)單獨(dú)對(duì)男性 進(jìn) 行 分析時(shí)，CP組 NLRP3 rs4612666位 點(diǎn) 的 CT、TT及 CT/TT基因型與CC基因型攜帶者比較，患CP的風(fēng)險(xiǎn)均 增 高（OR=2.09，95% CI=1.09～4.03，P=0.026；OR=2.86，95% CI=1.24～6.59，P=0.013；OR=2.27，95% CI=1.21～4.25，P=0.010），且T等位基因與C等位基因比較（OR=1.64，95% CI=1.11～2.43，P=0.012）患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。在女性組未觀察到任何基因型和等位基因頻率分布的差異。當(dāng)根據(jù)患者CP的嚴(yán)重程度（中度和重度）進(jìn)行分組分析時(shí)，未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表3）。

表3 NLRP3（rs4612666）C/T位點(diǎn)各基因型與慢性牙周炎風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)系分析結(jié)果

3 討論

為了更好了解牙周炎復(fù)雜的免疫發(fā)病機(jī)制，本病例對(duì)照研究分析了炎性小體NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性與牙周炎易感性的相關(guān)性。雖然已經(jīng)有研究報(bào)道非亞洲人種NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性與CP的關(guān)系［7］，本文是第一次針對(duì)此SNP在中國(guó)人群中牙周炎易感性的病例對(duì)照研究。作者進(jìn)行了嚴(yán)格的觀察對(duì)象篩選和基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3（rs4612666）位點(diǎn)CT和TT基因型與CP的遺傳易感性有關(guān)，尤其在男性人群中相關(guān)性顯著，但與牙周炎的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。

NLRP3突變等位基因C是1q44號(hào)染色體內(nèi)含子7上的一個(gè)單核苷酸突變，與野生等位基因T比較，該等位基因的轉(zhuǎn)錄活性更高。NLRP3的激活取決于通過(guò)模式識(shí)別受體PRRs識(shí)別病原相關(guān)分子模式PAMPs提供的信號(hào)，如微生物脂多糖（LPS）。為了證實(shí)這一生物學(xué)機(jī)制，大量體外研究表明牙齦卟啉單胞菌（Pg）、伴放線聚集桿菌（Aa）和聚核梭桿菌（Fn）等牙周致病菌參與了NLRP3的表達(dá)增加［8］。NLRP3的高表達(dá)刺激IL-1β和IL-18的分泌和成熟。NLRP3的誘導(dǎo)還涉及細(xì)胞死亡或損傷釋放的內(nèi)源性宿主因子，如ATP等。因此，除了病原體引起的NLRP3激活信號(hào)外，還應(yīng)考慮與NLRP3基因轉(zhuǎn)錄活性增高相關(guān)的基因多態(tài)性在牙周炎發(fā)病炎癥相關(guān)信號(hào)通路中的作用。

環(huán)境危險(xiǎn)因素與CP的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)，如吸煙習(xí)慣和性別等。與從不吸煙的人比較，吸煙人群患CP的風(fēng)險(xiǎn)更高，因吸煙會(huì)引起免疫抑制和細(xì)胞功能受損，如成纖維細(xì)胞促進(jìn)的組織修復(fù)，因此吸煙人群通常CP的嚴(yán)重程度更重，對(duì)牙周治療的反應(yīng)也較差［10］。本資料中，為了最大可能的避免偏倚，僅納入了非吸煙人群，以降低吸煙混雜因素的影響。此外，由于激素水平、口腔衛(wèi)生和不良的健康預(yù)防習(xí)慣等因素的性別差異，許多免疫基因遺傳變異被認(rèn)為是男性CP發(fā)生的易感因素，因此，按1∶1進(jìn)行性別匹配病例組和對(duì)照組。

本資料中，作者發(fā)現(xiàn)NLRP3 rs4612666位點(diǎn)CT和TT基因型與增高的男性CP的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。截止目前，有兩項(xiàng)研究調(diào)查了NLRP3基因多態(tài)性對(duì)牙周炎的影響［7，9］。其結(jié)果與作者相似，本研究考慮到性別差異，也按性別進(jìn)行了亞組分析，發(fā)現(xiàn)與女性比較，非吸煙男性CP患者的CT、TT基因型分布頻率更高（P＜0.05）。此外，作者又按照CP嚴(yán)重程度進(jìn)行了亞組分析，以研究NLRP3 rs4612666位點(diǎn)與牙周炎發(fā)展階段的關(guān)系，與健康對(duì)照組比較，中度CP和重度CP患者中均未觀察到相關(guān)性，提示NLRP3 rs4612666基因多態(tài)性可能與牙周炎的發(fā)病關(guān)系更為密切，而與牙周炎的進(jìn)展相關(guān)性不大。

本研究尚存在一些不足。首先，本研究納入樣本量相對(duì)較小，CP是多因素疾病，單基因SNP對(duì)牙周炎易感性的影響相對(duì)較小，可能需要大樣本量的病例對(duì)照研究才可以發(fā)現(xiàn)潛在的相關(guān)性。同時(shí)，協(xié)同相互作用在CP的致病途徑中發(fā)揮重要作用，因此多基因多SNP的基因-基因研究以及環(huán)境-基因協(xié)同作用研究可以更好的發(fā)現(xiàn)遺傳因素在CP發(fā)病中的作用。

綜上所述，男性NLRP3 rs4612666位點(diǎn)CT或TT基因型者可能罹患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)增高。將來(lái)，有必要在獨(dú)立的大樣本人群中對(duì)我們的結(jié)果進(jìn)行重復(fù)研究以驗(yàn)證這些關(guān)聯(lián)。