二氫楊梅素通過(guò)促進(jìn)AMPK活化抑制低氧誘導(dǎo)的H2c9心肌細(xì)胞凋亡

王 蕊,張鵬祥,李飛星,石金錚,郝翠君,李會(huì)賢

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,張家口 075000;*通訊作者,E-mail:drwang84@126.com)

二氫楊梅素(dihydromyricelin,DHM)是提取自藤茶的莖葉的一種二氫黃酮醇類多酚化合物,又名雙氫楊梅素、白蘞素、蛇葡萄素(ampelopsin,AMP)等[1]。DHM具有保肝護(hù)肝、抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤活性,對(duì)高血脂、高血壓以及血糖異常具有改善作用[2-7],近期有研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素對(duì)帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、抑郁癥及酒精成癮等也有很好的神經(jīng)保護(hù)活性[8-11]。

缺血性心臟病(ischemic heart disease,IHD)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷及隨后的心室病理性重構(gòu),是全世界心臟疾病致死的主要原因。據(jù)報(bào)道,2008年全球有超過(guò)1 700萬(wàn)人死于缺血性心臟病,且預(yù)計(jì)到2030年該數(shù)字可達(dá)到2 360萬(wàn)[12]。心臟局部缺血可致心肌細(xì)胞缺氧,從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、壞死等嚴(yán)重的不可逆損傷,其中缺氧所導(dǎo)致的過(guò)度凋亡是該疾病的病因之一。

本研究用低氧處理H2c9心肌細(xì)胞模擬心肌缺氧,并用二氫楊梅素處理低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,探究二氫楊梅素對(duì)低氧處理的心肌細(xì)胞的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

二氫楊梅素粉末(dihydromyricetin,DHM,≥98%)購(gòu)自中國(guó)上海Alladin公司,AMPK抑制劑Dorsomorphin、AMPK激動(dòng)劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside,AICAR),購(gòu)自美國(guó)APExBio公司?？筽-AMPK抗體、抗AMPK抗體、山羊抗兔IgG、抗β-actin抗體,購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。CCK-8試劑盒,購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,購(gòu)于碧云天生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將H2c9心肌細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))接種于含10%胎牛血清及1%雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的80%時(shí)傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H2c9細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H2c9細(xì)胞用胰酶消化制成細(xì)胞懸液,調(diào)整密度為5×105個(gè)/ml,每孔取100 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。將H2c9細(xì)胞分為對(duì)照組(20%O2)、10%O2組、5%組和2.5%O2組,觀察氧濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,或?qū)2c9細(xì)胞分為對(duì)照組(20%O2)、20%O2+40 μmol/L DHM組、5%O2組、5%O2+20 μmol/L DHM組、5%O2+40 μmol/L DHM組和5%O2+80 μmol/L DHM組,觀察二氫楊梅素對(duì)低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。繼續(xù)培養(yǎng)48 h按CCK-8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A450),計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)活力。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按1.3細(xì)胞分組,在H2c9細(xì)胞處理結(jié)束后,收集各組細(xì)胞,獲得樣品。按照Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)檢測(cè)AMPK和p-AMPK蛋白表達(dá)

為了探討DHM拮抗低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞是否與AMPK活性有關(guān),分別用40 μmol/L的DHM、10 nmol/L AICAR和5 mmol/L Dorsomorphin處理5%低氧狀態(tài)下培養(yǎng)的H2c9細(xì)胞三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,實(shí)驗(yàn)分為以下8組:20%O2(對(duì)照組)、5%O2組、5%O2+AICAR組、5%O2+DHM組、5%O2+Dorsomorphin組、5%O2+DHM+AICAR組、5%O2+DHM+Dorsomorphin組、5%O2+AICAR+Dorsomorphin組。提取各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入抗β-actin抗體、抗AMPK抗體及抗p-AMPK抗體(抗體稀釋比例均為1 ∶1 000),25 ℃孵育45 min。洗滌后加入HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗,4 ℃孵育過(guò)夜。充分洗滌后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng),用掃描儀對(duì)膠片進(jìn)行圖像掃描,保存結(jié)果,采用Quantity One Western blot圖像分析軟件進(jìn)行分析,測(cè)量條帶的光密度。蛋白的相對(duì)表達(dá)水平采用目的蛋白條帶的光密度與內(nèi)參條帶光密度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用LSD-t進(jìn)行差異性分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧誘導(dǎo)H2c9細(xì)胞活力下降和凋亡增加

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示,H2c9細(xì)胞培養(yǎng)48 h,隨著氧濃度的降低,H2c9細(xì)胞活力逐漸下降,氧濃度下降到5%時(shí),細(xì)胞活力下降最為明顯,隨著氧濃度繼續(xù)下降至2.5%,細(xì)胞活力無(wú)明顯下降,與20%O2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:隨著氧濃度的降低,H2c9細(xì)胞早期和晚期凋亡的比率依次增高,5%和2.5%O2濃度的凋亡率和20%O2濃度的相比有顯著性差異,且氧濃度為5%時(shí)細(xì)胞凋亡比例明顯增加(均P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與20%O2組比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 不同O2濃度下培養(yǎng)48 h H2c9細(xì)胞相對(duì)活力Figure 1 Relative viability of H2c9 cells after treated with different O2 concentrations for 48 h

圖2 不同O2濃度下培養(yǎng)48 h H2c9細(xì)胞凋亡率Figure 2 Apoptosis rate of H2c9 cells after treated with different O2 concentrations for 48 h

2.2 二氫楊梅素拮抗低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞凋亡

用濃度為10,20,40,80 μmol/L的DHM處理5%低氧狀態(tài)下培養(yǎng)的H2c9細(xì)胞48 h。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)及Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示:與5%O2組對(duì)比，5%O2+20 μmol/L DHM組、5%O2+40 μmol/L DHM和5%O2+80 μmol/L DHM組H2c9細(xì)胞活力明顯增加及凋亡率明顯降低(P<0.05)。隨著DHM濃度增加,拮抗低氧誘導(dǎo)所造成的H2c9細(xì)胞活力下降及凋亡越大,呈現(xiàn)濃度依耐性,DHM濃度增加至40 μmol/L時(shí),該拮抗能力增加最為明顯(P<0.05,見(jiàn)圖3和圖4)。以上結(jié)果表明,DHM可顯著降低低氧誘導(dǎo)的H2c9心肌細(xì)胞凋亡。

2.3 DHM抑制低氧誘導(dǎo)H2c9細(xì)胞AMPK活性下降

與20%O2組比較,5%O2組H2c9細(xì)胞內(nèi)的活性形式AMPK即磷酸化的AMPK(p-AMPK)蛋白水平顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖5)。與5%O2組比較,5%O2+AICAR組、5%O2+DHM組、5%O2+DHM+AICAR組中H2c9細(xì)胞中p-AMPK蛋白水平明顯增加(均P<0.05),而5%O2+DHM+Dorsomorphin組和5%O2+AICAR+Dorsomorphin組中H2c9細(xì)胞中p-AMPK無(wú)明顯增加(見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明:低氧可抑制H2c9細(xì)胞的AMPK活性,而DHM及AMPK激動(dòng)劑AICAR可明顯拮抗低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞AMPK活性下降,且AICAR與Dorsomorphin、DHM與Dorsomorphin同時(shí)使用時(shí),拮抗作用明顯被抑制,提示DHM通過(guò)激活A(yù)MPK的活化拮抗低氧誘導(dǎo)的AMPK活性下降,進(jìn)而抑制低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞凋亡。

與20%O2組比較,*P<0.05;與5%O2組比較,#P<0.05,##P<0.01圖3 不同O2及DHM濃度下培養(yǎng)48 h H2c9細(xì)胞相對(duì)活力Figure 3 Cell relative viability of H2c9 cells after treatment with different O2 and DHM concentrations for 48 h

圖4 不同O2及DHM濃度下培養(yǎng)48 h H2c9細(xì)胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of H2c9 cells after treatment with different O2 and DHM concentrations for 48 h

與20%O2組比較,*P<0.05;與5%O2組比較,#P<0.05圖5 Western blotting檢測(cè)DHM及AICAR對(duì)H2c9細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化的影響Figure 5 Effect of DHM and AICAR on AMPK phosphorylation in H2c9 cells detected by Western blotting assay

3 討論

心肌活動(dòng)消耗的ATP主要來(lái)自于有氧代謝,因此心肌對(duì)缺氧非常敏感。研究表明,心肌細(xì)胞供氧無(wú)法滿足線粒體氧化需要,導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)軗p,線粒體功能出現(xiàn)障礙,進(jìn)而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13-15]。

本研究結(jié)果揭示DHM對(duì)低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞活力下降及凋亡增加具有抑制作用。但是,其作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。白藜蘆醇(resveratrol,RES)、表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)、槲皮素、姜黃素等天然多酚類化合物對(duì)糖尿病、肥胖、心血管疾病等慢性病的防治作用受到日趨重視。大量研究表明,AMPK是多酚類化合物防治慢性病的重要靶點(diǎn)[16,17]。DHM作為藤茶中含量極高的一種黃酮類多酚化合物,可通過(guò)激活骨骼肌細(xì)胞AMPK信號(hào)通路改善骨骼肌胰島素抵抗,以及維持骨骼肌線粒體生物合成繼而抑制低氧條件下的體能下降[18,19],表明DHM也是天然的AMPK激活劑。有趣的是,本研究結(jié)果顯示低氧能夠抑制H2c9心肌細(xì)胞AMPK活性。于是,我們推測(cè)DHM對(duì)低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與AMPK活化有關(guān)。接著,我們發(fā)現(xiàn)與AICAR相似,40 μmol/L的DHM能夠促進(jìn)低氧作用下的H2c9心肌細(xì)胞AMPK活性。進(jìn)一步,我們使用了AMPK抑制劑Dorsomorphin以明確AMPK活化對(duì)DHM抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)作用。結(jié)果顯示,加入AMPK抑制劑Dorsomorphin后,DHM及AICAR對(duì)低氧誘導(dǎo)的H2c9細(xì)胞活力下降及細(xì)胞凋亡增加的抑制效應(yīng)被消弱。以上研究結(jié)果提示DHM可通過(guò)激活A(yù)MPK對(duì)低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用。

本研究中,使用40 μmol/L DHM干預(yù)5%低氧處理的H2c9細(xì)胞時(shí),細(xì)胞活力大幅提升,細(xì)胞凋亡率大幅下降,但與單獨(dú)20%O2組及40 μmol/L DHM+20%O2組的細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率仍有差異。在低氧條件下,H2c9心肌細(xì)胞凋亡、壞死,細(xì)胞活力下降。當(dāng)用40 μmol/L的DHM干預(yù)5%低氧處理的H2c9細(xì)胞時(shí),DHM抑制了細(xì)胞的凋亡,但由于40 μmol/L DHM的劑量不夠,沒(méi)有抑制所有細(xì)胞的凋亡。同時(shí),DHM干預(yù)未能抑制細(xì)胞的壞死,因此,用40 μmol/L DHM干預(yù)低氧處理的細(xì)胞時(shí),雖然細(xì)胞活力提升、細(xì)胞凋亡率下降,但并未達(dá)到對(duì)照組(20%O2組)的細(xì)胞活力水平。

綜上所述,AMPK活性抑制與低氧誘導(dǎo)H2c9心肌細(xì)胞活力下降、細(xì)胞凋亡增加等損傷效應(yīng)密切有關(guān),DHM可通過(guò)激活A(yù)MPK明顯抑制低氧誘導(dǎo)的H2c9心肌細(xì)胞凋亡,DHM激活A(yù)MPK拮抗低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的確切分子機(jī)制尚需深入研究。此外,本研究為使用DHM對(duì)缺血性心臟病的防治提供了新的思路。