miR-363-3p靶向PIK3CA調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移

朱茜文 安海燕 張亞平

(平頂山市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,平頂山 467000)

肺癌是世界范圍內(nèi)患病率較高的癌癥之一，根據(jù)腫瘤細(xì)胞微觀形態(tài)， 可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC是肺癌最主要的類型，占比超過85%[1]。盡管NSCLC治療取得了一定進(jìn)展，但很多NSCLC患者確診時(shí)已是晚期，只有不到18%患者存活超過5年[2]。miRNA是一類短鏈非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中扮演重要角色，在人類疾病中起重要作用，已有研究報(bào)道不同miRNA在包括NSCLC在內(nèi)的各種癌癥中起促癌或抑癌的作用，具有作為癌癥生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的應(yīng)用前景[3-5]。miR-363-3p是近年鑒定出的腫瘤抑制基因，在包括肝癌、乳腺癌、胃癌、直腸結(jié)腸癌等諸多癌癥中均報(bào)道其通過靶向作用于關(guān)鍵基因調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-363-3p在肺癌中可通過靶向作用于增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抑制腫瘤生長(zhǎng)，但作用機(jī)制尚不明確[6]。本研究通過培養(yǎng)人NSCLC細(xì)胞A549，并轉(zhuǎn)染miR-363-3p和磷脂酰肌醇激酶-3催化亞單位(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene,PIK3CA)過表達(dá)載體，從細(xì)胞水平初步探究NSCLC細(xì)胞中miR-363-3p與PIK3CA的調(diào)控關(guān)系及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，青鏈霉素、Trizol試劑、RIPA試劑、CCK8試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，BCA試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，miR-363-3p mimic、陰性對(duì)照mimic、PIK3CA重組表達(dá)載體(pcDNA 3.1-PIK3CA,pc-PIK3CA)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，所用引物由上海生工生物公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自日本Takara公司，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司，PIK3CA、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1蛋白、AKT、p-AKT抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。人NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在加入10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。

1.2.2分組及處理方法 細(xì)胞分為mimic NC、miR-363-3p、pc-PIK3CA、miR-363-3p+pc-PIK3CA組，根據(jù)lipofectamine 2000說明書，陰性對(duì)照mimic轉(zhuǎn)染mimic NC組細(xì)胞，miR-363-3p轉(zhuǎn)染miR-363-3p組細(xì)胞，pc-PIK3CA轉(zhuǎn)染pc-PIK3CA組細(xì)胞，miR-363-3p和pc-PIK3CA共轉(zhuǎn)染miR-363-3p+pc-PIK3CA組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-PCR檢測(cè) Trizol試劑提取細(xì)胞或組織RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書檢測(cè)mRNA及miRNA水平，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃ 5 s、60℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)，2-ΔΔCt法計(jì)算RNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，擴(kuò)增PIK3CA 3′-UTR區(qū)域，構(gòu)建pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型(MUT)載體，載體和miR-363-3p或陰性對(duì)照mimic成功轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5Western blot檢測(cè) RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白并通過BCA試劑盒定量，30 μg/孔點(diǎn)樣，10 % SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入適量一抗4℃孵育過夜，PBS清洗后加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。

1.2.6CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 常規(guī)條件培養(yǎng)細(xì)胞，每隔1 d CCK8試劑測(cè)定細(xì)胞增殖倍數(shù)，連續(xù)3 d。將細(xì)胞接種于96孔板，10 μl/孔加入CCK8試劑處理4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光值。

1.2.7劃痕愈合法檢測(cè)細(xì)胞遷移 細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)細(xì)胞至鋪滿板底80%后，中槍頭對(duì)細(xì)胞垂直水平畫線并通過PBS清洗，常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察拍照。

1.2.8Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲 Transwell小室加入50 μl基質(zhì)膠并于37℃凝固，上室加入無血清培養(yǎng)液，下室加入完全培養(yǎng)液，將細(xì)胞接種于小室上室，常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h，清洗掉未過膜的細(xì)胞，多聚甲醛固定剩余細(xì)胞，結(jié)晶紫染色觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1腫瘤組織中miR-363-3p表達(dá)量下調(diào) 對(duì)20例正常肺組織和NSCLC組織臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，與正常肺組織相比，NSCLC組織中miR-363-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，提示miR-363-3p可能參與NSCLC發(fā)展進(jìn)程，見圖1A。

2.2腫瘤組織中PIK3CA和miR-363-3p表達(dá)相關(guān)性 與正常肺組織相比，NSCLC組織PIK3CA mRNA水平顯著升高(P<0.01)，見圖1B。Spearman相關(guān)分析表明miR-363-3p和PIK3CA基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，見圖2。

2.3miR-363-3p靶向作用于PIK3CA 根據(jù)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-363-3p和PIK3CA靶向作用位點(diǎn)，與WT PIK3CA+mimic NC組相比，WT PIK3CA+miR-363-3p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，MUT PIK3CA+mimic NC組和MUT PIK3CA+miR-363-3p組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4miR-363-3p抑制PIK3CA基因表達(dá) 與A549空白對(duì)照組比較，mimic NC組中miR-363-3p表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與mimic NC組相比，miR-363-3p組miR-363-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，表明A549細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染miR-363-3p。與mimic NC組比較，miR-363-3p組細(xì)胞PIK3CA基因表達(dá)顯著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA組細(xì)胞PIK3CA基因表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組細(xì)胞PIK3CA基因表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見圖4。與mimic NC組相比，miR-363-3p組PIK3CA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA組PIK3CA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組PIK3CA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),見圖5。

圖1 RT-PCR檢測(cè)正常肺組織、NSCLC組織miR-363-3p、PIK3CA表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-363-3p and PIK3CA in normal tissues and NSCLC tissues by RT-PCR

圖2 NSCLC組織miR-363-3p和PIK3CA基因表達(dá)相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of miR-363-3p and PIK3CA gene expressions in NSCLC tissues

2.5miR-363-3p抑制腫瘤細(xì)胞增殖 與mimic NC組相比，miR-363-3p組A549細(xì)胞增殖水平顯著降低，pc-PIK3CA組細(xì)胞增殖水平顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組細(xì)胞增殖水平顯著降低(P<0.01)，見圖6。

圖3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-363-3p和PIK3CA靶向關(guān)系Fig.3 Relationship between miR-363-3p and PIK3CA by luciferase reporter assay

圖4 RT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞miR-363-3p、PIK3CA mRNA表達(dá)水平Fig.4 Expression level of miR-363-3p in A549 cells by RT-PCR

圖5 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞PIK3CA蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expression of PIK3CA in A549 cells by Western blot

圖6 CCK8法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖倍數(shù)Fig.6 CCK8 assays for measuring cell growth of A549 cells

圖7 劃痕愈合法檢測(cè)A549細(xì)胞遷移能力Fig.7 Wound healing test for migration ability of A549 cells

2.6miR-363-3p抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移 與mimic NC組相比，miR-363-3p組A549細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著降低，pc-PIK3CA組顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.01)，見圖7,8。

圖8 Transwell檢測(cè)A549細(xì)胞侵襲能力Fig.8 Transwell test for invasion ability of A549 cells

圖9 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及PI3K/AKT通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)Fig.9 Western blot for protein expression of and PI3K/AKT pathway proliferation,metastasis in A549 cells

2.7miR-363-3p對(duì)增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的調(diào)控 與mimic NC組相比，miR-363-3p組A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著降低，p-AKT/AKT比率顯著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA組A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著升高，p-AKT/AKT比率顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組比較，miR-363-3p+pc-PIK3CA組A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著降低，p-AKT/AKT比率顯著降低(P<0.01)，見圖9。

3 討論

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)家族來源于細(xì)胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶家族，可分為3個(gè)類型，其中研究最多的是Ⅰ類PI3K，可在體內(nèi)催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate,PIP3)，在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、代謝、生存及炎癥反應(yīng)等生理過程中起關(guān)鍵作用[7,8]。I類PI3K是異源二聚體，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成，p85亞基包含SH2和SH3結(jié)構(gòu)域，在缺乏激活信號(hào)時(shí)，p85抑制p110催化活性，當(dāng)包含對(duì)應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的受體酪氨酸激酶或接頭蛋白與p85相互作用，使PI3K被募集到質(zhì)膜部位，p110催化活性抑制被解除，參與PIP3催化合成[9]。PIK3CA基因編碼Ⅰ類PI3K的p110催化p110α，在包括NSCLC在內(nèi)的各種癌癥中均有起促癌作用[10-12]。miR-363-3p是新鑒定出的腫瘤抑制miRNA，Wang等[6]報(bào)道m(xù)iR-363-3p在肺腺癌中的抑癌作用，Liu等[13]報(bào)道 miR-363-3p可通過靶向作用于PIK3CA，抑制乳頭狀甲狀腺癌的增殖，推測(cè)在NSCLC中miR-363-3p的抑癌作用與PIK3CA相關(guān)。本研究對(duì)臨床NSCLC樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-363-3p在NSCLC組織中表達(dá)下調(diào)，PIK3CA基因表達(dá)上調(diào)，且密切相關(guān)。同時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-363-3p與PIK3CA的靶向作用，表明miR-363-3p可通過靶向作用于PIK3CA抑制PIK3CA表達(dá)。此外，本研究進(jìn)一步構(gòu)建PIK3CA過表達(dá)細(xì)胞株，并對(duì)細(xì)胞中的基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-363-3p可顯著降低PIK3CA的基因和蛋白表達(dá)，與之前結(jié)果相符。

PI3K/AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在各種癌癥中PI3K/AKT信號(hào)通路都可能發(fā)生異激活，因此該通路在腫瘤治療中常被作為靶向治療位點(diǎn)之一[14,15]。當(dāng)PI3K誘發(fā)PIP3生成后，PIP3與細(xì)胞內(nèi)包含PH結(jié)構(gòu)域的AKT和磷脂酰激酶依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide dependent kinase-1,PDK1)結(jié)合，參與誘導(dǎo)AKT激活，活化的AKT可通過磷酸化下游因子，調(diào)控增殖、凋亡及遷移等一系列細(xì)胞生長(zhǎng)過程[16]。研究表明PIK3CA可通過PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲與遷移，而部分miRNA如miR-1、miR-142-5p可通過靶向作用于PIK3CA抑制腫瘤生長(zhǎng)[12,17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-363-3p可顯著抑制AKT激活，并抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，PIK3CA過表達(dá)可抵消miR-363-3p對(duì)NSCLC細(xì)胞的影響。同時(shí)，miR-363-3p可顯著降低N-cadherin和Cyclin D1表達(dá)，提升E-cadherin表達(dá)，PIK3CA可抵消miR-363-3p對(duì)以及蛋白表達(dá)的影響。E-cadherin主要介導(dǎo)細(xì)胞間黏附反應(yīng)，維持上皮細(xì)胞形態(tài)，N-cadherin主要存在于間葉細(xì)胞，與E-cadherin作用相反，兩者常用作衡量腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的標(biāo)志物[18]。Cyclin D1是細(xì)胞周期的調(diào)控基因，其表達(dá)與細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換時(shí)間相關(guān)，可反映細(xì)胞增殖水平[19]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-363-3p可通過下調(diào)PIK3CA表達(dá)，抑制NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-363-3p可靶向作用于PIK3CA降低PIK3CA表達(dá)，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活，從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究從細(xì)胞水平初步探究NSCLC中miR-363-3p對(duì)PIK3CA的靶向作用及其對(duì)NSCLC細(xì)胞的影響，尚存不足，需要通過移植腫瘤動(dòng)物模型等方法進(jìn)一步驗(yàn)證miR-363-3p在體內(nèi)的作用。