青藤堿抑制CaN/NFAT通路信號(hào)抑制CIA骨破壞的研究①

張浩然 吉金雨 侯曉強(qiáng) 顏 嵐 梅志剛 馮知濤

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的慢性自身免疫性疾病，骨破壞是其最主要的特征之一[1]。骨破壞對(duì)關(guān)節(jié)的進(jìn)行性損傷不僅會(huì)導(dǎo)致后期的功能障礙，還會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。大量破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的形成是骨破壞的主要原因，目前的骨保護(hù)措施是抑制其分化成熟[3]。

青藤堿(sinomenine，SIN)是在中國(guó)傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤中提取的一種生物堿單體，是青風(fēng)藤中的主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制等多種藥理作用，自1921年，Ishiwari首次提取出該成分，用于RA的治療已有近百年的歷史[4-6]。臨床研究表明，SIN可有效延緩RA骨破壞的進(jìn)程，改善關(guān)節(jié)腫脹狀態(tài)[7-9]；在基礎(chǔ)研究中，SIN亦可通過(guò)抑制OC分化相關(guān)因子和信號(hào)通路降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)骨破壞[10-12]?；罨疶細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子c1(nuclear factor of activated T cells，cytoplasmic 1，NFATc1)作為OC分化下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，其可被鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CaN)活化進(jìn)而促進(jìn)OC分化成熟[13,14]。正常骨處于由成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)介導(dǎo)的骨形成和OC介導(dǎo)的骨吸收組成的動(dòng)態(tài)平衡。然而，在RA中大量OC的分化成熟導(dǎo)致該動(dòng)態(tài)平衡失衡，進(jìn)而導(dǎo)致了骨破壞[15]。有研究表明，CaN活化后可增加NFATc1蛋白表達(dá)水平加劇骨破壞[16]。此外，CaN基因敲除后可降低NFATc1蛋白表達(dá)水平從而延緩骨破壞[17]。提示CaN/NFAT信號(hào)通路在RA骨破壞中至關(guān)重要。然而，SIN雖可有效抑制RA骨破壞，但與CaN/NFAT的關(guān)系尚未闡明。為進(jìn)一步探討SIN是否可通過(guò)CaN/NFAT信號(hào)通路降低RA骨破壞，本研究建立了CIA模型，以期為臨床運(yùn)用SIN治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量(20±1)g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(鄂)2017-0061。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持環(huán)境恒溫恒濕，自由飲水，飼料固定。本研究方案經(jīng)三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑與儀器 主要試劑：完全弗氏佐劑(complete freund′s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete freund′s adjuvant，IFA)、牛二型膠原(collagen Ⅱ，CⅡ)購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；SIN購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小鼠單抗NFATc1購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔多抗CaN購(gòu)自proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自谷歌生物有限公司。主要儀器：酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利TECAN公司；磁力攪拌器購(gòu)自上海滬西分析儀器廠；搖床、掌型離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)其林貝爾公司；Western blot垂直電泳槽、Western blot電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自北京六一儀器廠；化學(xué)發(fā)光呈像系統(tǒng)購(gòu)自上海歐翔儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)格瑞恩科技有限公司；電子天平購(gòu)自中國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；脫水機(jī)(TP1020)、超薄切片機(jī)、倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1CIA模型的制備 雄性C57BL小鼠60只，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取6只為正常組，其余小鼠為造模組(排除造模失敗小鼠)。根據(jù)文獻(xiàn)[18]，取等體積CⅡ和CFA混合置于5 ml玻璃注射器，反復(fù)抽吸30 min(冰上操作)，直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散為度，制成抗原。造模小鼠尾根部注射抗原0.1 ml。3周后加強(qiáng)免疫，取CⅡ與等體積的IFA混合注射，造模小鼠尾根部再次注射抗原0.1 ml；正常組不予以任何處理。加強(qiáng)免疫后，剔除發(fā)病不明顯小鼠。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組(M組)、青藤堿低劑量組(SL組)、青藤堿高劑量組(SH組)各9只。

1.2.2給藥方法 初次免疫后第31天起，SL和SH組小鼠給予SIN 30 mg/kg、300 mg/kg灌胃，總共給藥12 d，1次/d。C組、M組給予等體積的生理鹽水，給藥時(shí)間與SL組、SH組相同。

1.2.3關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分方法 每日觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度。全身等級(jí)按5級(jí)評(píng)分評(píng)價(jià)，計(jì)算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI) 。AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：無(wú)紅腫；1分：足小趾關(guān)節(jié)紅腫：2分：小趾和足跖關(guān)節(jié)紅腫；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪均紅腫；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的整個(gè)足爪全部紅腫或者出現(xiàn)畸形。四肢評(píng)分之和(最高16分)為AI。AI越高，表明關(guān)節(jié)炎程度越嚴(yán)重[7]。

1.2.4小鼠關(guān)節(jié)病理切片 小鼠處死后，取雙后肢踝關(guān)節(jié)，于4%多聚甲醛中固定、常規(guī)脫鈣、脫水、石蠟包埋，切片后，光學(xué)顯微鏡觀察病理組織學(xué)變化：①炎癥細(xì)胞：關(guān)節(jié)有無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或纖維化；②滑膜組織：關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞有無(wú)變性，滑膜血管數(shù)量有無(wú)增多；③骨破壞：關(guān)節(jié)腔有無(wú)消失、纖維化，軟骨有無(wú)破壞或纖維化。HE染色病理切片指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分正常；1分輕度；2分中度；3分重度，每只小鼠足爪單個(gè)指標(biāo)得分≤3分[19]。

1.2.5免疫組化 選取小鼠滑膜組織切片，60℃烤箱烘烤1～2 h，常規(guī)脫蠟；0.01 mol/L、pH 6.0檸檬酸微波修復(fù)后取出玻片置于濕盒中PBS沖洗3次；干燥玻片周?chē)M織，配置3%H2O2室溫孵育，PBS沖洗3次(10 min/次)；正常山羊血清室溫封閉30 min；棄去封閉液，滴加兔多抗CaN(1∶200)、小鼠單抗NFATc1(1∶200)，4℃過(guò)夜；取出玻片，PBS沖洗3次(10 min/次)，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶200)、山羊抗小鼠抗體(1∶200)，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次(10 min/次)；配置DAB顯色液，現(xiàn)配現(xiàn)用，鏡下調(diào)節(jié)顯色適宜后流水沖洗，雙蒸水潤(rùn)洗；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2～3 min；常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。每組隨機(jī)抽取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本選取5個(gè)不同部位，于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，Image-Pro Plus圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性率。

1.2.6Western blot檢測(cè)CIA小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中CaNAα、NFAT的蛋白表達(dá) 選取小鼠四肢關(guān)節(jié)組織20～40 mg制備樣品，用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量；10%SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5 %脫脂奶粉封閉1 h，加入兔多抗CaN(1∶1 500)、小鼠單抗NFATc1(1∶250)，4℃孵育過(guò)夜，TBST充分洗膜3次(10 min/次)。將PVDF膜分別封入山羊抗兔抗體(1∶1 500)、兔抗小鼠抗體(1∶3 000)，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)。將ECL顯影液按照A液：B液=1∶1的比例配置發(fā)光液，將其均勻滴在PVDF膜上，放入凝膠成像儀器內(nèi)顯影。以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，Image J軟件計(jì)算各條帶灰度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白之比表示。

2 結(jié)果

2.1關(guān)節(jié)炎評(píng)分與關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化趨勢(shì) 加強(qiáng)免疫后每天進(jìn)行AI評(píng)分，關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如圖1A所示，0∶0分；1∶1分；2∶2分；3∶3分；4∶4分。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1B所示，造模后第37天，與C組相比，M組AI評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與M組相比，SL組、SH組AI評(píng)分明顯降低，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。造模后第39天，與C組相比，M組AI評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與M組相比，SL組、SH組AI評(píng)分明顯降低，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。造模后第41天，與C組相比，M組AI評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與M組相比，SL組、SH組AI評(píng)分明顯降低，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

2.2HE染色及病理評(píng)分 如圖2A所示，C組踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)清楚完整，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，滑膜細(xì)胞無(wú)增生、充血、水腫，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨細(xì)胞呈橢圓形，排列整齊。M組提示關(guān)節(jié)軟骨及骨組織破壞明顯，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞大量增生，纖維組織增生充血、水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)鄰近骨組織也有明顯破壞吸收，可見(jiàn)增生的纖維組織向骨髓腔內(nèi)侵入生長(zhǎng)；與M組比，SL組小鼠踝關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，軟骨及骨組織破壞有所改善，SH組小鼠踝關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯降低，骨破壞明顯減輕，表面光滑。病理評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2B，與C組相比，M組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨及骨破壞評(píng)分均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；與M組相比，SL、SH組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨及骨破壞評(píng)分均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

圖1 關(guān)節(jié)炎評(píng)分及其變化趨勢(shì)Fig.1 Arthritis index and its trends of each group

圖2 各組病理染色結(jié)果及評(píng)分(×400)

圖3 免疫組化檢測(cè)CaNAα、NFAT蛋白表達(dá)情況(×400)

圖4 Western blot檢測(cè)CaNAα、NFAT蛋白表達(dá)情況Fig.4 Protein expressions of CaNAα and NFAT by Western blot

2.3免疫組化檢測(cè)CaNAα、NFAT蛋白表達(dá) 各組結(jié)果如圖3A所示，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色點(diǎn)狀；與C組相比，M組CaNAα、NFAT表達(dá)顯著上調(diào)(圖3B，P<0.01)；給予SIN治療后，與M組相比，SL、SH組CaNAα、NFAT表達(dá)顯著下調(diào)，且呈劑量依賴性(圖3B，P<0.01)。

2.4Western blot檢測(cè)CaNAα、NFAT蛋白表達(dá) 與C組相比，M組CaNAα、NFAT蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與M組相比，SL、SH組CaN、NFAT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，P<0.01)。

3 討論

RA是一種臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，其基本病理特征包括慢性滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成及骨和軟骨的破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙等社會(huì)負(fù)擔(dān)[20]。2012年流行病學(xué)調(diào)查指出，我國(guó)RA患病率約占總?cè)丝诘?%，女性略高于男性，并存在區(qū)域差異[21]。延緩骨及骨質(zhì)的破壞，迅速達(dá)到低疾病活動(dòng)狀態(tài)是目前的主要治療目標(biāo)。近期研究表明，OC是導(dǎo)致骨破壞的主要原因，大量細(xì)胞因子和信號(hào)通路影響其分化成熟[12]。其中，CAN/NFAT信號(hào)通路在OC分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

CaN是一種Ca2+依賴型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其是一種異源二聚體，主要由與CaNB、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)相結(jié)合的催化亞基CaNA和與Ca2+相結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基CaNB組成[22]。CaNA由CaNAα、CaNAβ、CaNAγ三個(gè)基因編碼，但與Ca2+信號(hào)相關(guān)的是CaNAα基因[23]。細(xì)胞外的Ca2+通過(guò)其釋放活化的鈣通道(calcium-release activated calcium，CRAC)流入細(xì)胞質(zhì)，與CaM、CaNB相結(jié)合導(dǎo)致CaNA的構(gòu)象發(fā)生變化，徹底激活CaN[24]。未活化的NFATc1一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，處于高度磷酸化的狀態(tài)。被激活的CaN會(huì)活化其下游蛋白NFATc1進(jìn)而入核表達(dá)，促進(jìn)OC分化成熟[25]，最終導(dǎo)致大量OC形成，對(duì)骨關(guān)節(jié)產(chǎn)生破壞。Sun等[26]通過(guò)應(yīng)用CaNAα抑制劑及敲除CaNAα基因的方式，發(fā)現(xiàn)RAW-C3細(xì)胞由于NFATc1表達(dá)的降低，分化為OC的能力顯著下降[27]。此外，缺乏NFATc1信號(hào)激活的破骨細(xì)胞前體在RANKL存在的情況下無(wú)法完成正常分化。提示NFATc1可能是CaN/NFAT信號(hào)通路整合RANKL信號(hào)、調(diào)控OC終末分化的最重要轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明，黃芩苷、大麻素受體2激動(dòng)劑、圣草酚均可通過(guò)抑制NFAT的活性降低骨破壞[28-30]，提示NFAT與骨破壞密切相關(guān)。此外，Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，光色素可通過(guò)降低CaN、NFAT的表達(dá)減少CIA小鼠骨破壞。Guo等[32]發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A亦可通過(guò)抑制CaN/NFATc1信號(hào)通路活性降低CIA骨破壞。以上研究表明，抑制CaN/NFAT信號(hào)通路，從而抑制OC分化，進(jìn)而阻止關(guān)節(jié)炎骨破壞至關(guān)重要。

SIN是在中國(guó)傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤提取的一種生物堿單體，是青風(fēng)藤的主要有效成分，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制作用及較低的毒副作用[32]。既往研究表明，SIN聯(lián)合MTX、針刺、烏頭原堿均可有效緩解RA患者骨破壞進(jìn)程，改善關(guān)節(jié)腫脹[7-9]。此外，SIN可通過(guò)抑制OC分化相關(guān)信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signel transducers and activators of transcription，JAK/STAT)降低CIA小鼠骨破壞[33-35]。然而，SIN雖可有效延緩RA骨破壞，但其與CaN、NFAT的調(diào)控是否相關(guān)尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CIA模型，探討SIN是否可通過(guò)調(diào)控CaN/NFAT信號(hào)通路來(lái)降低CIA骨破壞。

本研究表明SL組和SH組小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀與模型組相比CIA 顯著減輕，SIN在治療效果上呈現(xiàn)出藥物劑量依賴性。通過(guò)HE染色和病理評(píng)分可以觀察到模型組關(guān)節(jié)組織出現(xiàn)高度異常的病理變化，如血管翳形成和關(guān)節(jié)軟骨破壞等。相反，SL組、SH組表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成減少、骨和軟骨破壞降低，且呈劑量依賴性。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)SIN抑制CIA炎癥進(jìn)展和骨破壞。由免疫組化、WB結(jié)果可知，CaN、NFAT蛋白表達(dá)水平在正常組表達(dá)較低，在CIA模型組表達(dá)明顯，SL組、SH組均可降低CaN、NFAT表達(dá)，尤其SH組較為明顯。因此，SIN可能是通過(guò)抑制CaN/NFAT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制OC分化，以此達(dá)到治療關(guān)節(jié)炎骨破壞的目的。綜上所述，CaN/NFAT是OC分化的重要信號(hào)通路，SIN可通過(guò)抑制CaN/NFAT信號(hào)通路活性，減少了OC分化，進(jìn)而抑制RA骨破壞。此外，在SIN給藥期間，小鼠未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，表明SIN安全性良好。但本實(shí)驗(yàn)未使用陽(yáng)性對(duì)照組，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。