約氏瘧原蟲(chóng)蛋白磷酸酶6免疫血清的傳播阻斷效果分析①

楊慧琳 周 丹 于園超 朱曉彤 崔立旺

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122)

傳播阻斷疫苗(transmission blocking vaccine，TBVs)通過(guò)瘧原蟲(chóng)有性階段抗原激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，因此，影響其有性發(fā)育過(guò)程會(huì)起到阻斷瘧疾傳播效果。由于TBVs候選抗原表達(dá)于蚊階段，不受人體免疫系統(tǒng)選擇壓力的影響，因此具有低多態(tài)性和良好的免疫原性等特點(diǎn)[1]。經(jīng)典的TBVs候選抗原包括：配子受精前期靶抗原P45/48、P230，受精后期靶抗原P25、P28和蚊中腸靶抗原HAP2[2-6]。雖然P45/48和P230具有明顯的傳播阻斷效果，但由于兩者在體外表達(dá)時(shí)無(wú)法正確折疊而阻礙了其發(fā)展[7-10]。P25和P28為動(dòng)合子表面蛋白，有研究證實(shí)，抗-Pbs25/28免疫血清可完全阻止瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)的發(fā)育[11]。Pvs25已經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其疫苗可減少80%的卵囊形成，但其傳播阻斷效果未達(dá)到100%。因此，探索新的TBVs候選抗原可為研發(fā)高效瘧疾傳播阻斷疫苗提供理論基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中最重要的調(diào)控方式，其參與細(xì)胞周期調(diào)控的各方面[12-14]。蛋白激酶(protein kinase,PK)與蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)負(fù)責(zé)調(diào)控這一過(guò)程的平衡，前者啟動(dòng)蛋白的磷酸化，后者促發(fā)蛋白的去磷酸化[15]。蛋白激酶已被公認(rèn)為重要的治療靶點(diǎn)，但蛋白磷酸酶只是作為臨床干預(yù)靶標(biāo)[16]。近幾年，關(guān)于瘧原蟲(chóng)PP的研究已成為熱點(diǎn)。根據(jù)氨基酸序列的同源性、結(jié)構(gòu)特征及催化機(jī)制的不同，PP可以分為四大家族:磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPPs)、磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶(phosphotyrosine residues phosphatases,PTPs)、Mg2+依賴的磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Mg2+-dependent phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPMs)和NLI相互作用因子樣磷酸酶(NLI-interatcting factor-like phosphatases,NIFs)[17]。PPM6屬于PPM/PP2C家族，其研究尚處于起步階段。

本項(xiàng)目采用生物信息學(xué)方法選取約氏瘧原蟲(chóng)PPM6(Plasmodiumyoeliiprotein phosphatase PPM6 (PyPPM6)，PlasmoDB accession no.PY02322)，探究其是否具有阻斷傳播效果。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供；雌性中華按蚊、P.y17XNL原蟲(chóng)株及其基因組DNA(gDNA)均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫教研室保存；KOD-Plus-Neo 購(gòu)自Toyobo 公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ 和NotⅠ、T4 DNA 連接酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Extraction Kit v4.0 購(gòu)自TaKaRa公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根公司；LB Broth 購(gòu)自Solarbio 公司；氨芐青霉素購(gòu)自GENVIEW 公司；1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清、IPTG購(gòu)自Hyclone公司；脫脂奶粉購(gòu)自BD DifcoTMSkim Milk 公司；Tween-20購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody、PierceTMECL Plus Western Blotting Substrate、HRP、6×His Tag Mono-clonal Antibody購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1PyPPM6基因合成及原核表達(dá)載體構(gòu)建 將1×107P.y17XNL原蟲(chóng)通過(guò)腹腔注射感染小鼠，3 d后，取50 μl尾血提取基因組DNA(gDNA)。以 gDNA為模板，采用引物：PyPPM6-BamHⅠF：5′-cgggatccAAAAATACATTTTTTTATAAGTCCC-3′；PyPPM6-NotⅠR：5′-ttgcggccgcTCGTTCCCATCTTCTCCATGA-CTCT-3′，擴(kuò)增PyPPM6功能區(qū)域(359-644 aa)。將上述PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切。同時(shí)，pET32a(+)原核表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ酶切，37℃孵育2 h，純化。用T4連接酶連接酶切后的PCR產(chǎn)物和pET32a(+)載體，16℃過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌Rosetta(DE)Competent Cell。菌落PCR鑒定，選取陽(yáng)性克隆株進(jìn)行小搖擴(kuò)增。用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，送華大基因公司測(cè)序。采用MEGA7.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2重組蛋白的表達(dá)與純化 選取pET32a(+)-PyPPM6陽(yáng)性克隆于3 ml LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37℃過(guò)夜。取1 ml菌液于250 ml LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min離心3 h，加入250 μl 1 mmol/L IPTG于20℃孵育16～18 h誘導(dǎo)PyPPM6-His重組蛋白(rPyPPM6-His)，采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化重組蛋白。將純化后的重組蛋白進(jìn)行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，25 V電壓下半干法轉(zhuǎn)PVDF膜30 min。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，TBS-T洗3次，每次10 min。采用抗-His標(biāo)簽抗體6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000)室溫孵育1 h。之后采用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h。ECL發(fā)光后采用熒光圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫 6～8周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分成2組，每組10只。組1為rPyPPM6-His免疫組(PyPPM6)；組2為PBS免疫組(NC)。采用50 μg 重組蛋白免疫小鼠。初次皮下免疫每隔周免疫1次，共免疫3次，每次免疫后第10天收集各組免疫血清。初次免疫采用弗氏完全佐劑，二免和三免采用弗氏不完全佐劑混合。

1.2.4血清特異性抗體水平檢測(cè) 將10 μg的rPyPPM6-His重組蛋白溶解于碳酸鹽緩沖液(pH=7.4)包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。采用含1%BSA的PBS封閉，37℃孵育1 h。PBS洗3次，加入用PBS緩沖液連續(xù)倍比稀釋抗-PyPPM6免疫血清，100 μl/孔，37℃孵育2 h。PBS洗3次，加入1∶5 000的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h。PBS洗5次，加入底物鄰苯二胺和過(guò)氧化氫進(jìn)行顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm處OD值。

1.2.5抗-PyPPM6免疫血清對(duì)瘧原蟲(chóng)性階段抑制效果的觀察 用1×107個(gè)P.y17XNL感染BALB/c小鼠，感染后第3天，感染率達(dá)到5%左右時(shí)，取10 μl 尾血與40 μl動(dòng)合子培養(yǎng)基混合，并將抗-PyPPM6免疫血清按1∶5 稀釋加至動(dòng)合子培養(yǎng)基中，25℃孵育15 min。取1 μl混合液涂片，30 min內(nèi)油鏡下計(jì)數(shù)雌雄配子體數(shù)和雌雄配子數(shù)以及出絲中心數(shù)；取10 μl尾血與90 μl動(dòng)合子培養(yǎng)基混合，將抗-PyPPM6免疫血清按1∶5 稀釋加到動(dòng)合子培養(yǎng)基中，25℃孵育24 h。用抗-Pys25抗體固定和標(biāo)記培養(yǎng)物進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，于熒光顯微鏡下計(jì)動(dòng)合子數(shù)并計(jì)算動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率；1×107個(gè)P.y17XNL感染BALB/c小鼠，感染后第3天，感染率達(dá)到3%左右，尾靜脈注射免疫血清1 h后，置于饑餓12 h的雌性按蚊籠中吸食血液1 h。7 d后解剖蚊胃，計(jì)數(shù)蚊胃壁的卵囊數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。其中，配子體出絲和動(dòng)合子數(shù)量比對(duì)分析采用Student′st檢驗(yàn)。卵囊密度組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1PyPPM6重組蛋白表達(dá)與免疫血清制備 本研究成功構(gòu)建pET32a (+)-PyPPM6原核表達(dá)載體。SDS-PAGE電泳后，可見(jiàn)大量PyPPM6重組蛋白(～40 kDa)表達(dá)(圖1A、B)。ELISA結(jié)果顯示，抗-PyPPM6免疫血清抗體滴度為1∶64 000(圖1C)。

2.2抗-PyPPM6免疫血清對(duì)雄配子體出絲的影響P.y17XNL原蟲(chóng)體外配子體出絲實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(PBS免疫血清)相比，1:5倍稀釋后的抗-PyPPM6免疫血清可使雄配子體出絲數(shù)目下降78.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

2.3抗-PyPPM6免疫血清對(duì)體外動(dòng)合子發(fā)育的影響 與PBS對(duì)照組相比，抗-PyPPM6免疫血清處理組動(dòng)合子數(shù)目下降78.7%(P<0.000 1，圖3A)；動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率下降55.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，圖3B)；間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3C。

2.4抗-PyPPM6免疫血清對(duì)蚊胃內(nèi)囊合子形成的影響 蚊胃內(nèi)囊合子形成實(shí)現(xiàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，吸食抗-PyPPM6免疫血清實(shí)驗(yàn)組小鼠血液的按蚊胃內(nèi)囊合子形成減少40.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，圖4)。

圖1 PyPPM6重組蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig.1 Detection of PyPPM6 recombinant protein expression

圖2 抗-PyPPM6免疫血清對(duì)雄配子體出絲的影響Fig.2 Effect of anti-PyPPM6 serum on male gametocyte exflagellation

圖3 抗-PyPPM6血清對(duì)動(dòng)合子數(shù)目和轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of anti-PyPPM6 serum on ookinete number and ookinete conversion rate

圖4 抗-PyPPM6血清對(duì)囊合子形成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of anti-PyPPM6 serum on oocysts formation

3 討論

可逆的蛋白磷酸化是多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程的關(guān)鍵，催化磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶已被明確為多種疾病的藥物靶點(diǎn)[18]。瘧原蟲(chóng)磷酸酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，瘧原蟲(chóng)約含有30種磷酸酶，其中50%以上的磷酸酶為紅內(nèi)期生長(zhǎng)發(fā)育必需蛋白[16]，然而，磷酸酶在有性發(fā)育過(guò)程中的作用尚不完全清楚。研究已知：PPM1與雄配子體出絲有關(guān)、PPM2與動(dòng)合子轉(zhuǎn)化有關(guān)[16]，PP5與雄配子形成有關(guān)[18]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PyPPM6蛋白主要表達(dá)在原蟲(chóng)有性發(fā)育階段(結(jié)果未顯示)。本研究中，PyPPM6重組蛋白免疫小鼠后，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗-PyPPM6特異性抗體水平顯著升高。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示抗-PyPPM6免疫血清能夠特異性結(jié)合內(nèi)源性PyPPM6蛋白。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示約氏瘧原蟲(chóng)PyPPM6重組蛋白免疫后的抗血清具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，為其作為傳播阻斷疫苗候選抗原提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前傳播阻斷疫苗候選抗原包括來(lái)自受精前階段抗原(例如 P230，P48/45)[19]，其具有加強(qiáng)免疫的優(yōu)勢(shì)。 抗Pfs230和Pfs48/45血清能夠阻止卵囊形成，具有明確的傳播阻斷活性[20，21]；與之相比 ，抗-PyPPM6免疫血清在體外可顯著抑制配子體出絲，抑制率達(dá)到78.8%，提示其可抑制雄配子體發(fā)育，并可能影響后續(xù)發(fā)育階段中的雄/雌配子體受精過(guò)程，具有一定的傳播阻斷活性。

為明確PyPPM6免疫血清的傳播阻斷效果，本研究分別進(jìn)行體外動(dòng)合子培養(yǎng)和蚊胃內(nèi)卵囊形成實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，當(dāng)在動(dòng)合子培養(yǎng)基中加入1:5稀釋的抗-PyPPM6免疫血清時(shí)，動(dòng)合子形成顯著減少，提示其可能抑制動(dòng)合子形成。蚊體內(nèi)卵囊形成實(shí)驗(yàn)顯示，抗-PyPPM6血清可顯著抑制蚊胃內(nèi)卵囊的形成。目前傳播阻斷疫苗候選抗原還包括來(lái)自受精后階段抗原(例如 P25，P28)[21]，其可以延長(zhǎng)抗體阻斷作用的時(shí)間?？筆fs25抗血清能夠完全抑制卵囊的形成，抗Pvs25抗血清能夠抑制80%卵囊的形成，具有明確的傳播阻斷活性[11,22,23]；與之相比，抗-PyPPM6血清可顯著抑制動(dòng)合子及卵囊的形成，抑制率分別為78.7%和40.4%，具有一定的傳播阻斷活性。

綜上所述，通過(guò)對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)PPM6蛋白免疫小鼠后的免疫功能特點(diǎn)以及傳播阻斷效應(yīng)的研究，證實(shí)了約氏瘧原蟲(chóng)PPM6具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。通過(guò)鼠瘧模型確定了約氏瘧原蟲(chóng)PPM6蛋白作為新的TBVs候選抗原的傳播阻斷能力，為惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)PPM6蛋白作為瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原的可行性研究提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。