ICAM-1參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡中免疫球蛋白產(chǎn)生的實驗研究①

李玉梅 劉 帥 劉芝翠 王樹軍 季 萍 潘 萌 張美玉④ 王 穎

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院輸血科，上海 201999)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是以多器官為靶點的自身免疫性疾病，主要病理特征是免疫系統(tǒng)功能紊亂，產(chǎn)生多種自身抗體并形成免疫復(fù)合物沉積于多個組織和器官，對機體造成病理性損傷[1]。在SLE復(fù)雜的致病過程中，活化的CD4+T細胞與B細胞的相互作用模式對B細胞的異?；罨l(fā)揮重要作用。

ICAM-1又稱CD54，是介導(dǎo)黏附的重要分子，通過與相應(yīng)受體特異性結(jié)合，增強免疫細胞間、細胞與基質(zhì)間的黏附作用，在T細胞活化早期，通過與抗原遞呈細胞(APC)表面配體分子結(jié)合，介導(dǎo)細胞間的非特異性黏附，從而為T細胞表面TCR受體與APC細胞表面MHC-抗原肽的相互識別提供前期準備[2，3]。ICAM-1在腫瘤惡化、轉(zhuǎn)移及調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)中起重要作用[4]。作為重要的黏附分子，ICAM-1在SLE中的表達水平如何，是否參與B細胞的異常激活和抗體產(chǎn)生值得深入研究。

本研究擬分析ICAM-1在SLE患者和SLE小鼠病理模型中的表達水平，初步探討其對IgG/IgM產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 血清學檢測的45例SLE患者來自于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院，診斷均符合1997年美國風濕病協(xié)會(ACR)修訂的SLE診斷標準，其中女性44例，男性1例，平均年齡(37.42±16.6)歲。收集SLE患者的臨床資料及實驗室檢查數(shù)據(jù)，并根據(jù)SLEDAI評分標準進行評估，SLE中度活動組(≥10分)29例，輕度活動組(5～9分)12例，基本無活動性組(0～4分)4例；37例復(fù)診患者已用藥，8例初診患者未用藥。實驗對照組選用我院體檢中心性別和年齡匹配的健康志愿者。所有患者及健康志愿者均已知情同意。

1.1.2小鼠 6～8周齡雌性BALB/c小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部SPF環(huán)境，20～24℃，相對濕度50%～60%，自由飲食，光照周期為日夜各12 h。

1.1.3試劑 抗人CD3-PerCP、抗人CD8-PE、抗人ICOS-PE和抗人CD69-PE購自eBioscience公司；抗人CD8-FITC、抗人HLA-DR-APC、抗人ICAM-1-PE-Cy5、抗鼠CD3-Percp-Cy5.5、抗鼠CD4-FITC、抗鼠CD44-APC-Cy7、抗CD62L-APC、抗鼠 ICOS-PE均購自BD公司；活化用可溶性抗CD3抗體購自BD公司;IFN-α購自Cell Science公司；抗鼠ICAM-1阻斷抗體和Pristane購自Thermo Fisher公司；小鼠CD4+T細胞和B細胞分選試劑盒購自STEMCELL公司；小鼠IgM和IgG檢測用試劑購自上海森雄公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自GIBGO公司；Fieoll-hypaque淋巴細胞分離液購自Axis公司。

1.1.4儀器 LSR Fortessa流式細胞分析儀(美國BD公司)；酶標儀、生物安全柜、超低溫冰箱(美國Thermo公司)；高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；水平搖床(Kylin-bell公司)。

1.2方法

1.2.1樣本收集 采集患者外周血3～5 ml，EDTA抗凝，1 500 r/min離心5 min，收集血漿，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ贓P中加入3 ml RPMI1640 培養(yǎng)液，置于等體積Ficoll-hypaque淋巴細胞分離液，2 200 r/min離心20 min，收集單個核淋巴細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)備用。

1.2.2人PBMCs細胞表型分析 在1.5 ml EP管中加入細胞，0.2 mol/管，加入3% FBS-1×PBS稀釋的工作抗體，分別為抗CD3-PerCP、抗CD3-PE、抗CD8-FITC、抗ICOS-PE、抗HLA-DR-APC、抗ICAM-1-PE-Cy5和抗CD69-PE；孵育30 min，加入1 ml PBS 洗滌，離心洗滌1次后，加入200 μl的FACS buffer重懸混勻，BD LSRFortessa流式細胞分析儀檢測。

1.2.3可溶性抗CD3抗體和IFN-α聯(lián)合活化CD4+T細胞 將抗CD3單克隆抗體按照2 μg/ml溶解至PBS，混勻后，按照200 μl/孔加到96孔平底板中，4℃冰箱水平放置，孵育過夜。設(shè)立未刺激組和刺激組，后者加入100 ng/ml IFN-α，將純化的CD4+T細胞(1×105個/孔)加入到已包被有抗CD3抗體的孔中；37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)24 h；流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞表型。

1.2.4狼瘡樣小鼠動物模型制備 6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為2組，每組6只。實驗組小鼠一次性腹腔注射0.5 ml Pristane溶液，對照組小鼠一次性腹腔注射0.5 ml無菌1×PBS溶液。所有動物實驗均按照上海交通大學醫(yī)學院動物實驗操作指南進行。6個月后處死小鼠，取脾臟。

1.2.5狼瘡樣小鼠模型血清中snRNR和dsDNA自身抗體檢測 分別用特異性抗原U1-snRNP 68/70 kD和dsDNA包板，用1×ELISA包被液將抗原稀釋至0.3 μg/ml，100 μl/孔，4℃孵育過夜。棄包被液，每孔加入300 μl洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌3次，吸水紙拍干。每孔加入200 μl封閉液，置于水平搖床(80 r/min)室溫孵育2 h。棄封閉液，每孔加入300 μl洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌3次，將稀釋好的樣本加入至封閉好的96孔酶標板中，陰性對照孔為未免疫的正常小鼠血清，空白對照孔為樣本稀釋液，100 μl/孔，水平搖床(80 r/min)室溫孵育2 h。棄樣本，300 μl/孔加入洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌3次，每孔加入100 μl辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG工作液(1∶4 000)，水平搖床(80 r/min)室溫孵育2 h。棄酶標二抗，每孔加入300 μl洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌7次，每孔加入100 μl 辣根過氧化酶的底物工作液，室溫避光孵育15 min，每孔加入50 μl 2N的H2SO4終止液，酶標儀測定OD450值。

1.2.6小鼠脾臟CD4+T細胞表面分子檢測 小鼠脾臟放入盛有PBS的培養(yǎng)皿(6 cm)中，研磨成單細胞懸液，1 500 r/min離心10 min。棄上清，加入5 ml 小鼠紅細胞裂解液，重懸脾臟細胞置于冰內(nèi)放置5 min，加入7 ml 1×PBS終止，1 500 r/min離心10 min。用10 ml 1×PBS重懸洗滌2次，計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度至2×107個/ml，將100 μl細胞懸液加入1.5 ml EP 管中，與抗鼠CD3-Percp-Cy5.5、抗鼠CD4-FITC、抗鼠CD44-APC-Cy7、抗CD62L-APC、抗鼠 ICOS-PE、抗鼠ICAM-1-APC工作液共孵育30 min，加入1 ml PBS洗滌，離心洗滌1次后，加入200 μl FACS buffer重懸混勻，F(xiàn)ortessa流式儀檢測。

1.2.7體外CD4+T-B細胞共培養(yǎng) (1)按照MACS分選試劑盒說明書分選獲得小鼠CD4+T細胞和B細胞，計數(shù)，分別調(diào)整細胞濃度為1.5×106個/ml和 4.5×106個/ml。(2)分別在96孔U底板預(yù)先加入100 μl完全培養(yǎng)基。(3)混勻CD4+T和B細胞懸液，按照以下方案設(shè)置共培養(yǎng)體系。① CD4+T或B細胞對照組：每孔加入50 μl PBS或Pristane處理小鼠來源的CD4+T或B細胞懸液，完全培養(yǎng)基定容至200 μl，每組設(shè)置3個復(fù)孔。② CD4+T-B細胞共培養(yǎng)實驗組：在預(yù)先加入完全培養(yǎng)基的孔中，按照下列組合方式分別加入50 μl細胞懸液，定容至200 μl，每組設(shè)置3個復(fù)孔。a組：PBS處理小鼠來源的CD4+T細胞和B細胞懸液。b組：Pristane處理小鼠來源的CD4+T細胞和PBS處理小鼠來源的B細胞懸液。c組：PBS處理小鼠來源的CD4+T細胞和Pristane處理小鼠來源的B細胞懸液。d組：Pristane處理小鼠來源的CD4+T和B細胞懸液。③使用排槍將每個孔中的細胞懸液混勻，周邊的孔用滴管加滿無菌的1×PBS溶液，用膠帶將96孔 U底板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)8 d后收集培養(yǎng)上清，ELISA檢測總IgG和IgM含量。

1.2.8小鼠IgM和IgG檢測 分別用羊抗鼠IgM (H+L)和IgG (H+L)作為捕獲抗體包板，用1×ELISA包被液將捕獲抗體分別稀釋為4 μg/ml和2 μg/ml，每孔加入100 μl，4℃孵育過夜。棄包被液，每孔加入300 μl洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌3次，吸水紙拍干。每孔加入200 μl封閉液，水平搖床(80 r/min)室溫孵育2 h。棄封閉液，每孔加入300 μl洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌3次，將稀釋好的樣本加入至封閉好的96孔酶標板中，陰性對照孔為未免疫的正常小鼠血清，空白對照孔為樣本稀釋液，每孔加入100 μl，水平搖床(80 r/min)室溫孵育2 h。棄樣本溶液，每孔加入300 μl洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌3次，每孔加入100 μl辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG工作液(用樣本稀釋液1∶4 000稀釋)，置于水平搖床(80 r/min)，室溫孵育2 h。棄酶標二抗，每孔加入300 μl洗滌液，室溫放置1 min，棄洗滌液，重復(fù)洗滌7次，每孔加入100 μl辣根過氧化酶的底物工作液，室溫避光孵育15 min，每孔加入50 μl 2N的H2SO4終止液，酶標儀測定OD450。

2 結(jié)果

2.1SLE患者外周CD4+T細胞表面活化分子和ICAM-1的表達顯著升高 與健康者比較，SLE患者來源的CD4+T細胞表面CD69和HLA-DR的陽性表達比例明顯上調(diào)(P<0.01)(圖1A、C)。進一步分析細胞表面的ICOS和ICAM-1表達水平，SLE患者來源的CD4+T細胞表面協(xié)同刺激分子ICOS的陽性表達率明顯增加(P<0.05)，ICAM-1表達差異無統(tǒng)計學意義(圖1B、C)。上述結(jié)果表明SLE患者體內(nèi)的CD4+T細胞與健康者相比處于活化增強狀態(tài)，同時輔助自體B細胞的重要輔助分子表達變化顯著。

2.2抗CD3/IFN-α協(xié)同處理后，健康者外周CD4+T細胞表面活化分子和ICAM-1表達顯著升高 與未刺激組相比，抗CD3/IFN-α刺激組CD4+T細胞表面CD69和HLA-DR的表達比例及MFI均顯著升高(P<0.05)(圖2A、C)。表面黏附分子ICAM-1的表達率及MFI顯著升高(P<0.05)，ICOS表達陽性率及MFI顯著升高(P<0.001)(圖2B、C)。上述結(jié)果表明抗CD3/IFN-α刺激CD4+T細胞后，CD4+T細胞活化狀態(tài)發(fā)生變化，其表面黏附分子和協(xié)同刺激分子表達不同程度升高，升高最為顯著的是黏附分子ICAM-1和協(xié)同共刺激分子ICOS。

2.3Pristane處理狼瘡樣小鼠中CD4+T細胞表面活化分子和ICAM-1表達水平 Pristane處理組小鼠CD4+T細胞表面CD44的表達較PBS組明顯上升(P<0.05圖3A)，CD62L表達下降(P<0.01，圖3B)，表明Pristane處理組小鼠外周CD4+T細胞呈活化狀態(tài)，與B細胞相互作用的共刺激分子ICOS的表達在Pristane小鼠中明顯高于PBS組(P<0.01，圖3C)，黏附分子ICAM-1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3D)。上述結(jié)果表明，Pristane誘導(dǎo)的狼瘡樣小鼠模型外周CD4+T細胞處于異?；罨癄顟B(tài)。

圖1 健康者及SLE患者外周CD4+T細胞活化表型比較Fig.1 Comparison of activation of peripheral CD4+T cell between healthy donors and SLE patientsNote:Compared with HC,*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖2 Anti-CD3 Ab/IFN-α刺激健康對照組CD4+T細胞的活化表型檢測Fig.2 Activation phenotype of healthy donors derived CD4+T cells stimulated by anti-CD3 Ab/IFN-αNote:Compared with No stim，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

2.4Pristane處理狼瘡樣小鼠模型血清中自身抗體水平 第0月時，2組小鼠外周血血清免疫球蛋白和自身抗體水平差異無統(tǒng)計學意義；第6月時，Pristane處理組小鼠外周血血清中抗sn-RNP、抗dsDNA 抗體水平顯著高于PBS對照組，表明Pristane處理后，小鼠體內(nèi)逐漸產(chǎn)生高滴度病理性自身抗體抗sn-RNP、抗dsDNA 抗體水平在發(fā)病后期明顯增高。見圖4。

2.5Pristane來源CD4+T細胞與B細胞共培養(yǎng)可以促進B細胞產(chǎn)生IgM和IgG 結(jié)果顯示，與a組(CT+CB)相比，b、c、 d組培養(yǎng)上清中總IgM和總IgG的產(chǎn)生水平升高，a組

圖3 Pristane處理組與PBS對照組小鼠脾臟CD4+T細胞表型分析Fig.3 Phenotype analysis of spleen CD4+T cells in Pristane group and PBS groupNote:Compared with PBS，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 小鼠血清中抗sn-RNP、dsDNA自身抗體的含量Fig.4 Levels of anti-sn-RNP and anti-dsDNA auto-antibodies serum of miceNote:Compared with PBS,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖5 不同來源的CD4+T和B細胞共培養(yǎng)后培養(yǎng)上清中IgM和IgG水平Fig.5 IgM and IgG levels in co-culture supernatants of CD4+T and B cells from different sourcesNote:Compared with c group，**.P<0.01.

圖6 阻斷ICAM-1對Pristane來源的CD4+T與B細胞共培養(yǎng)后培養(yǎng)上清中總IgM和IgG水平影響Fig.6 Effect of blocking ICAM-1 on total IgM and IgG levels in co-culture supernatants of Pristane-derived CD4+T and B cellsNote:Compared with ISO,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.6阻斷ICAM-1分子對Pristane來源CD4+T細胞與B細胞共培養(yǎng)后的IgM和IgG水平的影響 在2組共培養(yǎng)體系中加入阻斷抗體anti-ICAM-1 Ab后，對比加入IgG Isotype的對照組，上清中IgM含量差異無統(tǒng)計學意義(圖6A)，但IgG含量顯著升高(P<0.01或P<0.001，圖6B)。上述檢測結(jié)果提示，活化的CD4+T細胞輔助正?；蚧罨腂細胞產(chǎn)生抗體時，ICAM-1分子可促進T、B細胞相互作用，抑制IgM向IgG轉(zhuǎn)換。

3 討論

SLE是常見的自身免疫性疾病，其治療目的主要是幫助機體恢復(fù)正常的免疫耐受狀態(tài)，降低血清中免疫球蛋白的滴度，減輕免疫復(fù)合物在不同組織器官的沉積，改善患者的臨床癥狀[5]。目前，SLE常用的治療方案除了控制發(fā)病誘因外，主要采用免疫抑制劑阻止病理性自身免疫應(yīng)答[6]。因此，通過探索SLE的發(fā)病機理尋找高效低毒的單克隆抗體阻斷劑是目前SLE治療研究的重要方向。

ICAM-1/LFA-1的相互作用通常被用來穩(wěn)定細胞與細胞之間的連接以及促進淋巴細胞跨血管內(nèi)皮遷移[7]。在漿細胞性乳腺炎中，ICAM-1介導(dǎo)B細胞跨乳腺導(dǎo)管內(nèi)皮遷移，導(dǎo)致病變?nèi)橄俳M織中漿細胞增多，加重局部炎癥反應(yīng)；在視網(wǎng)膜炎癥中，ICAM-1介導(dǎo)B細胞跨血管內(nèi)皮遷移和炎癥嚴重程度有關(guān)；在B細胞來源的惡性淋巴瘤中，惡變的B細胞通過其表面的ICAM-1分子介導(dǎo)的細胞骨架重塑依賴的滾動、黏附和跨血管遷移播散到肝臟等處[8-10]。ICAM-1除參與B細胞的跨內(nèi)皮遷移外，還促進生發(fā)中心B細胞活化和分化。在生發(fā)中心，ICAM-1/LFA-1的相互作用可以促進B細胞與Tfh細胞黏附，降低B細胞的活化閾值；Tfh細胞表面CD40L激活B細胞CD40信號通路，促使ICAM-1和SLAM表達上調(diào)，ICAM-1/LFA-1和SLAM/SLAM增強Tfh-GC B相互作用，促進生發(fā)中心B細胞活化，促進亮區(qū)生發(fā)中心B細胞分化為前體漿細胞、漿細胞，最終促進抗體生成[11-13]。因此，根據(jù)ICAM-1分子在不同免疫功能紊亂性疾病中發(fā)揮的作用，阻斷ICAM-1可有效減輕炎癥損傷，抑制淋巴瘤遠處轉(zhuǎn)移，減少漿細胞形成和抗體生成。

本課題組發(fā)現(xiàn)Pristane誘導(dǎo)的狼瘡樣小鼠模型中CD4+T細胞表面ICAM-1表達增高，因此推測SLE患者中CD4+T細胞通過ICAM-1增強與B細胞間的黏附作用，促進B細胞產(chǎn)生病理性抗體，導(dǎo)致SLE。為此，本課題組通過功能性阻斷抗體anti-ICAM-1作用Pristane來源的CD4+T細胞與B細胞共培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)，與同型Isotype對照組相比，ICAM-1分子被阻斷后，Pristane來源的CD4+T細胞輔助PBS/Pristane來源的B細胞產(chǎn)生的IgM含量下降IgG含量顯著升高。研究結(jié)果提示，活化的CD4+T細胞表面ICAM-1分子被阻斷中和后，可抑制T-B相互作用及B細胞活化，降低抗體IgM產(chǎn)生；而抗體IgG水平顯著升高，則提示CD4+T表面ICAM-1分子可能通過直接接觸的方式抑制B細胞內(nèi)IgM向IgG轉(zhuǎn)換。SLE患者中CD4+T細胞表面ICAM-1表達水平增加，促進T-B細胞黏附與B細胞的活化，但抑制IgM向IgG轉(zhuǎn)換。

免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換(CSR)是發(fā)生在B細胞核內(nèi)染色體上免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(C區(qū))的刪除性的基因重組[14]。通常認為免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換和體細胞高頻突變(SHM)同時發(fā)生在生發(fā)中心反應(yīng)中，均由活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(AID)介導(dǎo)[15]。然而，最新研究表明免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在生發(fā)中心形成前早期的T-B細胞相互作用過程中，當T細胞遷移到濾泡區(qū)形成生發(fā)中心后，類別轉(zhuǎn)換重組的頻率迅速降低，SHM頻率顯著升高，即CSR和SHM的發(fā)生具有時空特異性[16]。功能紊亂的CSR會導(dǎo)致自身反應(yīng)性BCR和B細胞源性淋巴瘤的產(chǎn)生。成熟的IgM-IgD B細胞在CD4+T細胞的輔助和分泌的多種細胞因子的作用下發(fā)生CSR，使IgM轉(zhuǎn)換為IgA、IgG和IgE，并清除外源性抗原[17]。在生發(fā)中心形成前，CD4+T表面的CD40L通過刺激B細胞表面CD40產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB轉(zhuǎn)位，促進AID表達和CSR；此外，LPS激活固有免疫應(yīng)答受體TLR也可以促進CSR[18]。同時，CD40信號在IL-4信號的協(xié)同作用下促進IgM轉(zhuǎn)換為IgG1和IgE，在IFN-γ協(xié)同作用下轉(zhuǎn)換為IgG2a，在TGF-β協(xié)同作用下轉(zhuǎn)換為IgA[17,19]。

除CD40、TLRs外，跨膜活化和CAML激活因子(TACI)和B細胞活化因子(BAFF)也可以正向調(diào)控AID表達和CSR[17]。然而，這些受體信號(包括BCR信號)在誘導(dǎo)CSR的同時也激活PI3K-AKT信號通路。PI3K-AKT通路可以通過FOXO1、ID2和BLIMP1抑制AID表達和CSR；而PTEN蛋白通過將PI3K去磷酸化拮抗其抑制CSR的作用[17,20]。因此，PI3K-AKT信號通路和PTEN磷酸酶在免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換的過程中，互相拮抗，共同維持CSR穩(wěn)態(tài)。

在T-B細胞相互作用過程中，CD4+T細胞表面CD40L傳導(dǎo)的CD40信號正向調(diào)控AID表達和CSR；而BCR信號復(fù)合物的活化啟動了B細胞內(nèi)系列的信號分子事件，包括PI3K-AKT通路的激活，抑制AID表達和CSR產(chǎn)生。機體通過正負反饋調(diào)控CSR共同維持免疫穩(wěn)態(tài)。CD4+T細胞表面ICAM-1與B細胞相互作用可以顯著降低BCR活化閾值，而與B細胞直接接觸后能促進LFA-1信號通路的活化并通過Crk蛋白間接誘導(dǎo)啟動下游PI3K信號[11，21]，由此提示，ICAM-1-LFA-1在T-B細胞相互作用過程中可能通過促進PI3K-AKT通路的活化，從而抑制AID表達和CSR反應(yīng)中IgM向IgG轉(zhuǎn)換。

本研究發(fā)現(xiàn)SLE來源的CD4+T細胞一方面通過ICAM-1的介導(dǎo)促進與B細胞的黏附作用促進病理性抗體的產(chǎn)生，另一方面通過抑制早期T-B細胞相互作用下發(fā)生的免疫球蛋白IgM向IgG的類別轉(zhuǎn)換影響病理性抗體的類別，而影響SLE的發(fā)生發(fā)展?？傊?，本研究為闡明SLE發(fā)病機理提供了細胞學和分子學層面的新見解，為自身免疫性疾病的治療提供了新思路。