miR-152在IL-6誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲中的作用及其機(jī)制

徐書方 劉立秋 張玉清 張 艷 孫月菊 范 星 苗莉娜 李 娟

(石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，石家莊 050599)

宮頸癌是威脅女性身體健康的常見惡性腫瘤，而持續(xù)性人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染導(dǎo)致的微環(huán)境異常引起慢性炎癥是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因[1]。IL-6是腫瘤微環(huán)境的主要炎癥介質(zhì)之一，可由單核巨噬細(xì)胞和活化的淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，在機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)能夠刺激宮頸癌細(xì)胞異常增殖和轉(zhuǎn)移[2-4]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮致癌或抑癌作用的內(nèi)源性非編碼RNA分子，可與靶基因3′非編碼(UTR)區(qū)域結(jié)合影響靶基因的降解或翻譯，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。miR-152是于miR-148/152家族成員，在乳腺癌、卵巢癌和口腔鱗癌等腫瘤中異常表達(dá)，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲發(fā)揮抑癌作用[5-7]。有研究證實(shí)，IL-6可抑制膽管癌和胃癌細(xì)胞中miR-152表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)移[8,9]，但miR-152是否參與IL-6誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲并不清楚。因此，本研究以重組人IL-6處理宮頸癌Hela細(xì)胞，旨在闡明miR-152在IL-6誘導(dǎo)Hela細(xì)胞增殖和侵襲中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞庫，胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI1640培養(yǎng)基購于美國(guó)Hyclone公司，重組人IL-6購于美國(guó)Peprotech公司，ECL顯影液、CCK-8試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，Matrigel膠購于美國(guó)BD公司，PVDF膜和Transwell小室購于美國(guó)Millipore公司，WNT1、β-catenin、GAPDH抗體購于美國(guó)Santa Cruz公司，MMP-9、CyclinD1抗體購于美國(guó)Abcam公司，脂質(zhì)體2000購于美國(guó)LifeTech公司，miR-152模擬物及其陰性對(duì)照購于廣州銳博生物公司。

1.2方法

1.2.1Hela細(xì)胞培養(yǎng) 采用37℃水浴鍋經(jīng)凍存的Hela細(xì)胞快速解凍后，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI1640完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min后，棄上清液。再加入RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔1 d更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪于瓶底時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。取第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)Hela細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種至96孔細(xì)胞板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入終濃度為0.5、5和50 ng/ml IL-6，另外以加入等量培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對(duì)照(0 mg/ml)組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，棄上清。參照CCK-8試劑盒說明書加入10 μl CCK-8試劑孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在570 nm處的光密度OD值。

1.2.3Transwell法檢測(cè)Hela細(xì)胞侵襲 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞種植于24孔板，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。以0、0.5、5和50 ng/ml IL-6分別處理細(xì)胞24 h。使用50 μl濃度為50 mg/L Matrigel基質(zhì)膠對(duì)Transwell小室底部膜的上室面進(jìn)行包被，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中融合1 h。收集IL-6處理后的各組細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并使細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。取100 μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室上室中，并于下室內(nèi)加入含血清的培養(yǎng)液600 μl。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將小室取出。小心拭去上室內(nèi)的細(xì)胞與基質(zhì)膠后，以甲醛對(duì)小室膜底固定15 min，并以0.5%結(jié)晶紫染色15 min。經(jīng)雙蒸餾水漂洗后，晾干。采用顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)各組中的穿膜細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以隨機(jī)選取的5個(gè)視野中穿膜細(xì)胞數(shù)的均值表示。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)Hela細(xì)胞中miR-152的表達(dá) 收集IL-6處理48 h的各組Hela細(xì)胞，加入1 ml Trizol試劑提取總RNA，并使用超微量紫外可見分光光度計(jì)對(duì)總RNA的濃度與純度進(jìn)行測(cè)量。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，根據(jù)上海生工生物公司合成的引物，配制總體積為20 μl的PCR反應(yīng)體系，按照(94℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入40個(gè)循環(huán)：94℃ 變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s)擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法評(píng)估各組細(xì)胞中miR-152的表達(dá)水平。

1.2.5Western blot檢測(cè)Hela細(xì)胞中WNT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 參照總蛋白提取試劑盒說明書步驟抽提Hela細(xì)胞總蛋白，并使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。以4∶1比例在蛋白樣品中加入5×Loading buffer，混勻后沸水浴中變性5 min。將變性蛋白按照每泳道80 μg加入到SDS-PAGE凝膠中，以100 V電壓電泳，溴酚藍(lán)接近分離膠底部時(shí)終止電泳，再以350 mA恒流轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜用TBST稀釋的5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，加入TBST稀釋1 000倍的特異性一抗(WNT1、β-catenin、CyclinD1、MMP-9和GAPDH抗體)，于4℃孵育過夜。再以TBST稀釋5 000倍的二抗室溫孵育1 h。暗盒中，滴加ECL底物顯色液顯影定影后，凝膠成像儀拍照，Image J 軟件分析目的條帶的灰度值，并以GAPDH為內(nèi)參規(guī)范各目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.6Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞種植于6孔板上，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)至70%融合度時(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000說明書步驟將miR-152模擬物及其陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)至Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后給予50 ng/ml IL-6處理24 h，并分別標(biāo)記為IL-6+miR-152組、IL-6+miR-NC組，另將未經(jīng)任何處理的Hela細(xì)胞作為對(duì)照組，將只給予50 ng/ml IL-6處理而未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞作為IL-6組。待處理結(jié)束后，分別采用CCK-8法、Transwell法、RT-PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、侵襲能力以及各組細(xì)胞中miR-152表達(dá)水平和WNT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-152和WNT1的靶向關(guān)系 使用TargetScan、miRanda及miRBase三大靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-152與WNT1 3′UTR區(qū)域存在互補(bǔ)的核苷酸序列。構(gòu)建野生型(WNT1-WT)和突變型(WNT1-MUT)WNT1 3′UTR熒光素酶載體，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將WNT1-WT和WNT1-MUT分別與miR-152模擬物及其陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染，并分別標(biāo)記為miR-152+WNT1-WT組、miR-NC+WNT1-WT組、miR-152+WNT1-MUT組、miR-NC+WNT1-MUT組。轉(zhuǎn)染48 h后，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1IL-6誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲 與對(duì)照組(0 ng/ml)相比，0.5、5和50 ng/ml IL-6處理后Hela細(xì)胞在24～72 h的增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)；同時(shí)，不同濃度IL-6處理組中侵襲細(xì)胞數(shù)較對(duì)照的均明顯升高(P<0.05)；且細(xì)胞增殖和侵襲能力均呈現(xiàn)IL-6濃度依賴性。見圖1。

2.2IL-6下調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-152表達(dá) 以0、0.5、5和50 ng/ml IL-6處理后Hela細(xì)胞中miR-152的表達(dá)量分別為1.00±0.06、0.82±0.05、0.68±0.03和0.46±0.03，各組間miR-152表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.987，P=0.000)。與對(duì)照(0 ng/ml)相比，IL-6處理組中miR-152表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且IL-6濃度越大Hela細(xì)胞中miR-152的表達(dá)越低。

2.3IL-6促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞中WNT/β-catenin信號(hào)通路活化 進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著IL-6作用濃度的增加，Hela細(xì)胞中WNT/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白WNT1、β-catenin及下游蛋白CyclinD1和MMP-9的表達(dá)水平均顯著升高，與對(duì)照組(0 ng/ml)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4WNT1是miR-152的靶基因 采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到WNT1 3′ UTR區(qū)域與miR-152存在互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖3A。雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC+WNT1-WT組相比，miR-152+WNT1-WT組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，miR-152可與WNT1 3′ UTR靶向結(jié)合；miR-152+WNT1-MUT組細(xì)胞的熒光素酶活性與miR-NC+WNT1-MUT組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3B。

2.5miR-152過表達(dá)逆轉(zhuǎn)IL-6對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、侵襲以及WNT/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控 與對(duì)照組相比，IL-6組Hela細(xì)胞中miR-152表達(dá)水平顯著降低，而細(xì)胞增殖、侵襲能力以及細(xì)胞中WNT1、β-catenin、CyclinD1和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與IL-6組相比，IL-6+miR-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而IL-6+miR-152組中miR-152表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖、侵襲能力以及細(xì)胞中WNT1、β-catenin、CyclinD1和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。成功上調(diào)miR-152表達(dá)后，IL-6對(duì)Hela細(xì)胞增殖侵襲的促進(jìn)以及對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用均得到顯著逆轉(zhuǎn)。見圖4。

圖1 不同濃度IL-6對(duì)Hela細(xì)胞增殖和侵襲的影響Fig.1 Effects of different concentrations of IL-6 on proliferation and invasion of Hela cellsNote: A.OD value of Hela cells stimulated by IL-6 at different times;B.The colony formation rate of Hela cells after IL-6 stimulation;C.The invasion of Hela cells after IL-6 stimulation.Compared with 0 ng/ml,*.P<0.05.

圖2 不同濃度IL-6對(duì)Hela細(xì)胞中WNT1/β-catenin信號(hào)通路的影響Fig.2 Effects of different concentrations of IL-6 on WNT1/β-catenin signaling pathway in Hela cellsNote: A.Expression of WNT1,β-catenin,CyclinD1 and MMP-9 protein by Western blot;B.Expression level of WNT1,β-catenin,CyclinD1 and MMP-9 protein.Compared with 0 ng/ml,*.P<0.05.

圖3 miR-152與WNT1靶向關(guān)系的驗(yàn)證Fig.3 Verification of targeting relationship between miR-152 and WNT1Note: A.The binding site of WNT1 3′ UTR and miR-152;B.The luciferase activity of each group of cells.Compared with the miR-NC+WNT1-WT group,*.P<0.05.

圖4 miR-152過表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞中WNT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of miR-152 overexpression on expression of WNT/β-catenin signaling pathway-related proteins in Hela cellsNote: A.The relative expression level of miR-152;B.The OD value;C.The number of invading cells;D.The result of Western blot;E.The expression level of WNT1,β-catenin,CyclinD1 and MMP-9 protein.Compared with the control group,*.P<0.05;compared with IL-6 group,#.P<0.05.

3 討論

慢性炎癥是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件，IL-6作為一種重要的炎癥因子，可通過激活PI3K/Akt、Stat3/Nrf2和NF-κB信號(hào)通路等參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程[9-11]。IL-6被證實(shí)在宮頸癌患者外周血中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及HR-HPV感染密切相關(guān)[12]。文獻(xiàn)報(bào)道指出，以外源性IL-6處理宮頸癌細(xì)胞后可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲[4,13]。本研究以重組人IL-6刺激宮頸癌Hela細(xì)胞后進(jìn)一步證實(shí)了上述IL-6誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的研究結(jié)果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)IL-6刺激可抑制Hela細(xì)胞中miR-152表達(dá)。這提示miR-152可能在IL-6誘導(dǎo)的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用。

miR-152是一個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和周期進(jìn)展等在包括結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤和胃癌等多種腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用[14-16]。有研究指出，miR-152在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可通過靶向KLF5抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展[17]。另外，文獻(xiàn)證實(shí)在IL-6誘導(dǎo)胃癌MGC-803增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中miR-152表達(dá)下調(diào)是其重要的分子機(jī)制[9]。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-152模擬物成功上調(diào)miR-152表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，IL-6誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞增殖、侵襲均受到明顯抑制。結(jié)果表明，miR-152參與IL-6誘導(dǎo)的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲過程。

WNT/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑，其異常活化與包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切；當(dāng)WNT信號(hào)激活后，β-catenin在胞漿中聚集，使β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活下游靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和轉(zhuǎn)移[18,19]。有研究指出，IL-6可通過激活WNT/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究以IL-6刺激宮頸癌Hela細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Hela細(xì)胞中WNT/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子WNT1、β-catenin以及下游靶基因CyclinD1和MMP-9的表達(dá)水平均明顯升高[20]。這提示IL-6可能通過激活WNT/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)Hela細(xì)胞增殖和侵襲。

為進(jìn)一步探討miR-152參與IL-6誘導(dǎo)的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制，本研究采用靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-152潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-152與WNT1 3′UTR存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-152可與WNT1 3′ UTR靶向結(jié)合。另外，成功上調(diào)miR-152表達(dá)后，IL-6誘導(dǎo)的WNT1、β-catenin、CyclinD1和MMP-9蛋白的表達(dá)水平均明顯受到抑制。有研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤的研究中miR-152可通過靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞增殖[21]。結(jié)果提示，miR-152可通過靶向調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路參與IL-6誘導(dǎo)的宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲。

綜上所述，IL-6可通過下調(diào)miR-152表達(dá)，誘導(dǎo)其靶基因WNT1表達(dá)，進(jìn)而激活WNT/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲過程，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。該結(jié)果進(jìn)一步闡述了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，也為進(jìn)一步尋找宮頸癌治療靶點(diǎn)提供了方向。