卵黃抗體提取方法的優(yōu)化

張曼，柳溪，叢日華，通信作者

卵黃抗體提取方法的優(yōu)化

張曼1，柳溪2，叢日華2，通信作者

（1. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

近年來，卵黃抗體因不發(fā)生交叉反應(yīng)且特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為了免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，研究表明，動(dòng)物經(jīng)口服用從蛋黃中分離的IgY可以預(yù)防或治愈消化系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病，但缺乏適用于大批量生產(chǎn)的工業(yè)化工藝?，F(xiàn)有的純化方法主要有：沉淀法、層析法與超濾法，3種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中沉淀法是目前最有潛力用于量化生產(chǎn)的方法，但存在效價(jià)和得率不能兼顧的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)選用經(jīng)滅活新城疫病毒免疫后的母雞所產(chǎn)雞蛋分離得到的卵黃原液，經(jīng)聚乙二醇濃度梯度提取后測(cè)試，結(jié)果顯示質(zhì)量濃度為3.5%、8.0%和12.0%時(shí)連續(xù)純化效果最佳。此外，經(jīng)物理分離法分離蛋黃與蛋清，所得卵黃原液中蛋清的殘余量幾乎為零，消除了蛋清中的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)對(duì)純化的影響。經(jīng)過物理分離及3次連續(xù)純化獲得的卵黃抗體經(jīng)BCA試驗(yàn)和SDS-PAGE檢測(cè)顯示，抗體純度可達(dá)80%左右，采用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，平均滴度可達(dá)213。經(jīng)試驗(yàn)證明，用緩沖液透析后，IgY提取物可以在-20 ℃下儲(chǔ)存超過一年。該優(yōu)化的提純方法既保證了效價(jià)，又保證了產(chǎn)量，且試驗(yàn)流程簡潔、成本低廉，為卵黃抗體純化工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

卵黃抗體；蛋白質(zhì)純化；聚乙二醇；新城疫病毒；血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)

IgY作為一種廉價(jià)的多克隆抗體，已有多個(gè)報(bào)道表明IgY是治療胃癌[1]、囊性纖維化疾病[2]以及齲齒[3]的一種新方法，并且在預(yù)防疾病上也有良好效果[4-7]。在胚胎發(fā)育晚期，IgY通過卵黃囊膜轉(zhuǎn)運(yùn)到胚胎血流中，這種轉(zhuǎn)移類似于哺乳動(dòng)物的垂直傳播。研究表明，IgY從血清轉(zhuǎn)移到蛋黃是受體介導(dǎo)的過程，可發(fā)生母體血清抗體選擇性轉(zhuǎn)移[8]。雞蛋里的IgY主要集中在蛋黃中，而IgA和IgM則存在于蛋清中[9]。IgY和IgG之間存在功能相似性，IgY的H鏈具有1個(gè)可變區(qū)（VH）和4個(gè)恒定區(qū)（CH），而IgG僅有3個(gè)CH區(qū)，但I(xiàn)gY缺乏CH1和CH2結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈區(qū)，因此其結(jié)構(gòu)不如IgG靈活，而IgY安全性明顯優(yōu)于哺乳動(dòng)物IgG，不會(huì)引發(fā)潛在的危險(xiǎn)免疫反應(yīng)[10-11]。此外，IgY具有比IgG抗體更多的疏水性結(jié)構(gòu)，并且具有更低的等電點(diǎn)[6]，這可保證IgY的穩(wěn)定性。IgY分子可以在4 ℃保存5～10年且活性沒有顯著損失，在室溫下儲(chǔ)存6個(gè)月或在37 ℃下儲(chǔ)存1個(gè)月可以保持活性不變，-20 ℃可長期儲(chǔ)存，但在-70 ℃下儲(chǔ)存可導(dǎo)致50％的活性損失。據(jù)報(bào)道[1]，IgY抗體在pH 4和pH 11之間穩(wěn)定，在較低pH值時(shí)活性降低，這可能是由于改變了抗原結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象，而在堿性條件下至pH 11時(shí)穩(wěn)定，但在pH≥12時(shí)失去活性。

目前對(duì)IgY的純化方法主要有：沉淀法、層析法與超濾法，3種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中，沉淀法是目前最有潛力用于量化生產(chǎn)的方法，但沉淀法往往存在效價(jià)和得率不能兼顧的情況。因此，本試驗(yàn)擬利用物理分離法和聚乙二醇濃度梯度方法優(yōu)化卵黃抗體的提取純度，以期為卵黃抗體純化工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

雞卵、磷酸鹽緩沖液（PBS）、硫酸銨、聚乙二醇6 000（PEG 6 000）。

1.1.2 儀器

50 mL離心管、量筒、燒杯、漏斗、濾紙、移液槍、卵黃分離器、離心機(jī)、500 mL離心瓶。

1.2 方法

1.2.1 卵黃抗體的制備（硫酸銨法）

（1）在無菌條件下，對(duì)免疫雞群所產(chǎn)雞蛋進(jìn)行卵黃原液提取，并用PBS溶液進(jìn)行10倍稀釋后等分成10份。

（2）根據(jù)硫酸銨飽和度，即10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，計(jì)算達(dá)到相應(yīng)飽和度所需的硫酸銨質(zhì)量進(jìn)行配比，并上下顛倒混勻，室溫放置15 min。

（3）7 500 r/min離心15 min，觀察上清渾濁程度與底部沉淀量，依據(jù)上清渾濁且底部沉淀較多的硫酸銨濃度（飽和度X）和上清澄清與底部沉淀較少的硫酸銨濃度（飽和度Y）為原則進(jìn)行篩選，確定選取30%與50%的硫酸銨濃度。

（4）用PBS對(duì)卵黃原液進(jìn)行等比稀釋，加入飽和度為30%的硫酸銨，4 ℃靜止1 h。

（5）5 000 r/min 離心20 min，棄去上清。

（6）再用PBS緩沖液溶解沉淀至原IgY體積，加入硫酸銨至飽和度為50%。

（7）5 000 r/min 離心25 min取沉淀。

（8）重復(fù)步驟4至步驟7，經(jīng)2～3遍后可獲得IgY純度較好的卵黃抗體液。

1.2.2 卵黃抗體的制備（聚乙二醇法）

（1）將蛋殼小心地破碎，將蛋黃轉(zhuǎn)移到卵黃分離器中，并盡可能多地去除蛋清。

（2）將蛋黃轉(zhuǎn)移到濾紙上，滾動(dòng)除去剩余的蛋清，然后用刺血針或移液管尖切割卵黃膜，將蛋黃倒入錐形量筒中，共獲取247 mL的卵黃原液。

（3）將蛋黃體積兩倍的PBS與蛋黃混合，定容至740 mL，轉(zhuǎn)移至兩個(gè)離心瓶內(nèi)，各370 mL，然后分別加入總體積3.5％的PEG 6 000（/，以g計(jì)），渦旋混勻10 min。注意觀察離心瓶內(nèi)的液體，該步驟將懸浮液分成兩相，即由蛋黃固體和脂肪物質(zhì)相和含有IgY和其他蛋白質(zhì)的水相。

（4）將離心瓶在4 ℃下離心20 min（10 000 r/min），將上清液（約250 mL）倒入折疊的濾紙中并轉(zhuǎn)移到新的離心瓶中。

（5）將8％ PEG 6 000 g（根據(jù)新體積計(jì)算）加入離心瓶中，充分混勻10 min。

（6）將離心瓶在4 ℃下離心20 min（10 000 r/min），棄上清。

（7）使用玻璃棒和渦旋器將沉淀小心地溶解在PBS中，并加入與原始體積量（370 mL）相同的PBS，將溶液與12％PEG 6 000（/，44.4 g）混合，充分混勻10 min。

（8）將離心瓶在4 ℃下離心20 min（10 000 r/min），并將沉淀小心地溶解于PBS中，待氣泡消失后，將提取物轉(zhuǎn)移到多個(gè)透析膠囊中。

（9）將提取物在0.1％鹽水中透析過夜，并使用磁力攪拌器攪拌。第二天早上，用PBS替換鹽水再透析3 h。

（10）然后用移液管從透析膠囊中取出IgY提取物并轉(zhuǎn)移到2 mL試管中，每個(gè)透析囊中體積約為2 mL。采用BCA試劑盒檢測(cè)該蛋白含量。將樣品等分后，于-20 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃度梯度測(cè)試

本試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)聚乙二醇法進(jìn)行了優(yōu)化，加入3.5% PEG 6 000離心后，再進(jìn)行后續(xù)濃度梯度提取試驗(yàn)，比較沉淀質(zhì)量，結(jié)果如表1所示。可以看出在PEG 6 000質(zhì)量濃度為8%時(shí)沉淀出現(xiàn)了峰值，但沉淀的顏色仍為淡橙色，說明還有大量雜蛋白未除去，這時(shí)可再一次使用濃度為12%的PEG 6 000進(jìn)行純化沉淀，可以觀測(cè)到此次的沉淀為純白色，且體積稍有下降。

表1 PEG濃度梯度測(cè)試結(jié)果

濃度5%6%7%8%9%10%11% w/v 質(zhì)量/g3.4145.6776.1827.2566.9105.9364.859

2.2 物理分離

在多次重復(fù)試驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)，如果第一次離心獲得的上清渾濁，最終獲得的沉淀固體質(zhì)量也會(huì)大幅減少。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵黃原液中的蛋清和卵黃膜殘留均可影響上清的澄清度，因?yàn)榈扒迮c卵黃膜含有與卵黃截然不同的脂質(zhì)與蛋白質(zhì)，卵黃抗體也與之存在著不同程度的親和度，可顯著影響IgY從液相中萃取的效果。在本試驗(yàn)中增加了步驟1與步驟2，利用濾紙吸附了殘余的蛋清，并且使卵黃膜也黏著在濾紙上，去除了約99%的蛋清與卵黃膜，從而解決了上清渾濁的問題。

2.3 溫度測(cè)試

溫度對(duì)雙水相的形成有著重要的影響，主要是由于低溫會(huì)影響聚乙二醇的溶解度，從而影響雙水相的形成，如在4 ℃條件下進(jìn)行試驗(yàn)操作則無法形成雙水相。所以本研究盡量避免直接使用從冰箱中取出的雞蛋，或使用冷藏過的磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行稀釋，以避免沉淀中出現(xiàn)PEG 6 000的晶體殘余。

2.4 效價(jià)檢測(cè)

對(duì)獲得的IgY抗體進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 三次血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果

樣本第一次第二次第三次 Polson法沉淀后樣品282829 3.5%PEG沉淀后樣品215215215 8.0%PEG沉淀后樣品214214214 12.0%PEG沉淀后樣品214213213

結(jié)果表明，優(yōu)化后的方法可大幅提高IgY樣品的效價(jià)，原始方法的效價(jià)滴度僅為29，而優(yōu)化過的方案可達(dá)到213。此外，根據(jù)血凝抑制試驗(yàn)（表2）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在純化過程中IgY的效價(jià)會(huì)有一定程度的下降，但每次純化下降的幅度僅為1個(gè)滴度左右，獲得的成品滴度在213左右。通常制作疫苗的抗體滴度要求為26，如果使用2 mL的提取原液生產(chǎn)規(guī)格為2 mL的疫苗，則可制作128支滴度為26的疫苗，效果十分理想。

2.5 BCA試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)際濃度，得表3。

表3 BCA試驗(yàn)結(jié)果

樣本吸光度濃度（μg/μL） 3.5％PEG沉淀后的樣品1.26316.607 8.0％PEG沉淀后的樣品1.01012.979 12.0％PEG沉淀后的樣品0.477 5.365 12.0％PEG沉淀透析后的樣品0.414 4.467

BCA試驗(yàn)結(jié)果表明，在純化過程中總蛋白含量在不斷下降，特別是加入12.0%的PEG 6 000離心沉淀后，濃度下降了一倍多，但結(jié)合血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)IgY抗體的效價(jià)并沒有在這一步下降，說明純化除去的蛋白質(zhì)中大部分是其他無關(guān)的蛋白，也表明了利用該方法可獲得純度較高的IgY卵黃抗體。

2.6 SDS-PAGE

分別用蛋黃原液、3.5％PEG沉淀后的樣品、8.0％PEG沉淀后的樣品、12.0％PEG沉淀后的樣品及透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。SDS-PAGE結(jié)果表明，獲得的IgY分子結(jié)構(gòu)正確，在65和27 kDa處分別有一條明顯的條帶，即HC-重鏈與LC-輕鏈，而35至45 kDa的條帶可能是卵黃蛋白原II前體的C-末端片段。在使用3.5％PEG沉淀后，可根據(jù)條帶大小不同，洗脫時(shí)增加PEG濃度至8.0％以及12.0％時(shí)，非特異性條帶完全消失。對(duì)于一些較小的蛋白，仍可采用透析法進(jìn)行進(jìn)一步去除。

圖1 SDS-PAGE

注：泳道1為Marker，泳道2為蛋黃原液，泳道3為3.5％PEG沉淀后的樣品，泳道4為8％PEG沉淀后的樣品，泳道5為12％PEG沉淀后的樣品，泳道6為透析后樣品。IgY-HC≈65 kDa，LC≈27 kDa

3 討論

禽的免疫系統(tǒng)主要由胸腺和法氏囊介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫組成，當(dāng)受到抗原刺激時(shí)，由法氏囊產(chǎn)生的B細(xì)胞可分化成漿細(xì)胞，可分泌特異性的抗體，這些抗體經(jīng)過血液循環(huán)運(yùn)送至機(jī)體各部位，當(dāng)循環(huán)至卵巢時(shí)，特異性抗體在卵細(xì)胞中積累，繼而形成卵黃抗體。由特異抗原獲得的卵黃抗體在免疫動(dòng)物時(shí)，這些抗體可與細(xì)胞膜結(jié)合，改變細(xì)胞表位，抑制或減少相應(yīng)病原菌與細(xì)胞的接觸，降低病毒病或細(xì)菌病的發(fā)生。此外，雖然IgY與IgG性質(zhì)相似，但I(xiàn)gY比較穩(wěn)定，可在機(jī)體內(nèi)維持較長的時(shí)間，增加抗體的免疫效果，因此，在禁止使用抗生素的時(shí)期，卵黃抗體成為部分人類或動(dòng)物疾病預(yù)防或治療的最佳替補(bǔ)物質(zhì)。通過給雞進(jìn)行免疫注射后，對(duì)所產(chǎn)雞蛋進(jìn)行分離卵黃提取抗體，用于疾病的預(yù)防和治療[12-15]。

IgY雖然在數(shù)量方面無法與IgG單克隆抗體相比，但其具有IgG所不具有的獨(dú)特性質(zhì)，如不激活哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)，與HAMA（人抗小鼠抗體）、類風(fēng)濕因子或人血型抗原沒有交叉反應(yīng)性，增加了使用IgY的安全性[16-17]。此外，由于雞和哺乳動(dòng)物遺傳距離較遠(yuǎn)，且免疫系統(tǒng)存在差異，有助于提高抗體的特異性，因此與兔相比，雞更易產(chǎn)生抗哺乳動(dòng)物蛋白的抗體。而且，如果用相同的哺乳動(dòng)物抗原對(duì)雞和兔進(jìn)行免疫，雞通常會(huì)比兔具有更強(qiáng)的特異性。此外，從動(dòng)物福利角度看，IgY具有另外一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，即抗體是從蛋黃中非入侵性提取，對(duì)母雞本身并不造成任何傷害。

量化提純方式是阻礙IgY生產(chǎn)的重要阻力之一，傳統(tǒng)的硫酸銨純化法雖然是經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化方案，但因卵黃中脂類含量較高而不適用，雖然殘余的硫酸銨更易從最終的樣品中被去除（通過透析），但如果堅(jiān)持用硫酸銨法進(jìn)行沉淀，則必須使用接近實(shí)際生產(chǎn)量的體積測(cè)定飽和度（X）與飽和度（Y），這勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生大量的資源浪費(fèi)。

本研究成功優(yōu)化了一種可獲得高質(zhì)量IgY且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的提取方法。BCA檢測(cè)和SDS-PAGE分析均顯示該方法所獲的IgY具有較高的純度，避免了蛋清蛋白或卵黃膜對(duì)卵黃抗體的影響。此外，經(jīng)過HI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)最終獲得的抗體具有高達(dá)213的穩(wěn)定滴度，所以，無論是制作疫苗還是生產(chǎn)其他藥品，該提取物都可作為優(yōu)質(zhì)的原料。但目前如果要進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，除大容量離心機(jī)外，大批量蛋黃與蛋清的分離會(huì)是一個(gè)亟待解決的問題，如果分離不完全會(huì)大大降低IgY的提取效率，若使用人工分離，耗時(shí)耗力。

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Method optimization of IgY antibody extraction

ZHANG Man1, LIU Xi2, CONG Ri-hua2, Corresponding Author

（1. Yangling Vocational & Technical College, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China）

In recent years, yolk antibody has become a hot research in immunology due to their no cross reaction and strong specificity. Studies have shown that IgY isolated from egg yolk can prevent or cure digestive or respiratory-related diseases, but there is still lack of industrial processes suitable for mass production. The existing purification methods are mainly divided into precipitation, chromatography and ultrafiltration method, with their own advantages and disadvantages. Among them, precipitation method is the most potential method to be applied in quantitative production; however, the precipitation method often cannot achieve both potency and yield. In this study, the yolk stock solution isolated from eggs produced by hens immunized with inactivated Newcastle disease virus was selected and tested by polyethylene glycol concentration gradient extraction. The results showed that the continuous purification of 3.5%, 8.0% and 12.0% were the best. In addition, the obtained yolk stock solution was almost without egg white after the separation of egg yolk and egg white by physical separation method, which eliminated the effects of protein and lipid in egg white on purification. The yolk antibody obtained through physical separation and three consecutive purification can reach purity of about 80% by BCA and SDS-PAGE tests, and the average titer was 213using a hemagglutination inhibition test. And this study showed that IgY extract can be stored at -20 ℃ for more than one year after dialysis with buffer. The present study showed that the optimized purification method guarantees both potency and yield, and the test process is simple and of low cost, which lays the foundation for the research and development of industrialized production method of yolk antibody purification.

IgY; protein purification; polyethylene gly; avian pneumo-encephalitis virus; blood coagulation test and hemagglutination inhibition test

1008-5394（2020）02-0056-05

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.013

S852.4

A

2019-11-06

楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)科研項(xiàng)目（A2016042）

張曼（1979-），女，副教授，博士，主要從事家禽疫病防控技術(shù)研究。E-mail：1647864117@qq.com。

叢日華（1973-），男，副教授，博士，主要從事動(dòng)物生理基礎(chǔ)方面的研究。E-mail：crihua1232@163.com。

責(zé)任編輯：張愛婷