基于生物信息學(xué)的食管鱗狀細(xì)胞癌生物標(biāo)志物的篩選

郭永東，靳晶，郭甜甜，李利敏，賀宇彤

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所，石家莊050000

近年來，隨著發(fā)病率和病死率的上升，惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類生命健康的重要原因。食管癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的最新數(shù)據(jù)顯示，全球食管癌新發(fā)病例約57.2萬例，分別居惡性腫瘤發(fā)病和病死順位的第11和第8位[1]。中國是食管癌的高發(fā)國家，2015年，食管癌新發(fā)病例47.79萬例，病死37.50萬例[2]。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌的主要組織亞型，占全部食管癌的91%[3]。隨著診療技術(shù)的發(fā)展，食管癌患者的生存率明顯改善，但食管癌患者缺乏早期的臨床癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已處于臨床晚期，預(yù)后較差，5年生存率不足21%[4]。

ESCC是多階段綜合性作用的結(jié)果，影響其發(fā)生發(fā)展的因素較多，吸煙、飲酒及飲食等多種外部因素和基因驅(qū)動(dòng)、基因突變等內(nèi)部因素的綜合作用是導(dǎo)致ESCC的發(fā)生發(fā)展主要原因[5]，研究發(fā)現(xiàn)，多種基因可作為食管癌的分子標(biāo)志物，促進(jìn)食管癌的發(fā)生發(fā)展[6-8]；還有多種抑癌基因可抑制食管癌的發(fā)生和發(fā)展[9-12]。目前，臨床缺少基因集作為ESCC診斷的生物標(biāo)志物的研究，因此，深入的研究探討ESCC發(fā)生的影響因素和潛在分子標(biāo)志物基因集，有助于ESCC的早期預(yù)防、精確診斷和靶向治療?；蚪M學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等的研究可為發(fā)現(xiàn)ESCC的特異性生物標(biāo)志物提供方向?；虮磉_(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）是由美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，收錄了多個(gè)國家研究機(jī)構(gòu)提交的高通量測序表達(dá)數(shù)據(jù)，可以為眾多的研究提供方向。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載獲得兩組研究機(jī)構(gòu)的ESCC測序數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選鑒定出具有特異性篩查和潛在治療靶標(biāo)的基因集作為ESCC患者的分子標(biāo)志物，以期為ESCC患者的早期預(yù)防、精確診斷和治療提供有價(jià)值的分子標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)及差異性表達(dá)基因的鑒定

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載得到 GSE17351[13]和 GSE20347[14]的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，將下載所得芯片探針名稱根據(jù)平臺(tái)注釋進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換，且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[15]。若存在多個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)基因名的情況，則取其表達(dá)量最大的作為此基因的表達(dá)值（表1）。差異基因的篩選由微陣列數(shù)據(jù)的線性模型（linear models for microarray data，limma）[15]軟件完成，以log2FC≥2，P＜0.05作為差異基因篩選的截?cái)嘀禈?biāo)準(zhǔn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)集所得上下調(diào)基因由韋恩圖[16]取交集，進(jìn)行后續(xù)分析，熱圖和火山圖由heatmaply軟件[17]繪制。

表1 數(shù)據(jù)信息

1.2 通路富集分析

應(yīng)用 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線數(shù)據(jù)庫對(duì)所獲得上下調(diào)差異基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）/京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，GO分析包括生物過程、分子功能和細(xì)胞成分，數(shù)據(jù)可視化由R包c(diǎn)lusterprofile[18]完成。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

用于相互作用基因庫檢索工具（search tool for the retrieval of interacting genes，STRING）（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)搜索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫。本研究應(yīng)用檢索基因/蛋白質(zhì)相互作用基因庫檢索工具STRING對(duì)差異性表達(dá)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，然后導(dǎo)入cytoscape[19]進(jìn)行量化及后續(xù)操作，結(jié)合得分≥0.6、節(jié)點(diǎn)數(shù)≥4為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 差異基因集的驗(yàn)證

腫瘤基因組圖譜計(jì)劃是由美國國家癌癥研究所（national cancer institute，NCI）和美國國立衛(wèi)生研究院（national institute of health，NIH）下屬的國家人類基因組研究所（national human genome research institute，NHGRI）于 2006年聯(lián)合啟動(dòng)的項(xiàng)目，目的在于對(duì)導(dǎo)致腫瘤的主要基因組進(jìn)行研究分類，創(chuàng)建一個(gè)完整的腫瘤基因組圖譜，為廣大研究者提供公開可用的數(shù)據(jù)集，來幫助改進(jìn)診斷方法，治療技術(shù)，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、精準(zhǔn)抗腫瘤的目的。腫瘤基因組圖譜計(jì)劃的目的是研究個(gè)人的基因組變異如何影響基因表達(dá)、導(dǎo)致生物學(xué)差異（人體組織和細(xì)胞的健康狀態(tài)和患病狀態(tài)）。在蛋白交互網(wǎng)絡(luò)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因且顯著性富集于GO及KEGG通路中的基因集在腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）和基因型組織表達(dá)（the genotype-tissue expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因表達(dá)的驗(yàn)證。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 3.5.0軟件對(duì)所-有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異性表達(dá)基因的篩選

對(duì)下載數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后，GSE17351共有542個(gè)差異基因（上調(diào)基因196個(gè)，下調(diào)基因346個(gè)），GSE20347共有594個(gè)差異基因（上調(diào)基因242個(gè)，下調(diào)基因352個(gè)）（圖1）。分別對(duì)GSE17351和GSE20347的差異性表達(dá)上下調(diào)基因取交集，所得上調(diào)基因59個(gè)，下調(diào)基因91個(gè)（圖2），進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 差異基因的GO富集分析和KEGG通路分析

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中GSE17351和GSE20347的差異基因

圖2 藍(lán)色為GSE17351，黃色為GSE20347

GO富集分析結(jié)果顯示，生物過程主要富集于核分裂、膠原分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)組織、角化和表皮細(xì)胞分化等；分子功能主要富集于金屬內(nèi)肽酶活性、單加氧酶活性和結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)等；細(xì)胞成分主要富集于微管、驅(qū)動(dòng)蛋白復(fù)合物及細(xì)胞外泌體等（表2、表3）。KEGG通路分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要參與白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、腫瘤中的微小RNA（microRNA，miRNA）、腫瘤中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）信號(hào)通路，下調(diào)基因主語參與藥物代謝-細(xì)胞色素P450、花生四烯酸代謝和化學(xué)致癌作用等通路途徑（圖3）。

表2 差異性表達(dá)上調(diào)基因的GO分析

表3 差異性表達(dá)下調(diào)基因的GO分析

圖3 KEGG通路富集分析

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

基于STRING數(shù)據(jù)庫，59個(gè)上調(diào)基因和91個(gè)下調(diào)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖由cytoscape軟件繪制。在此蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中富含脯氨酸小蛋白（small proline-rich protein，SPRR3）、甲狀腺激素受體相互作用因子13（thyroid hormone receptor interacting protein 13，TRIP13）和基質(zhì)金屬蛋白酶 3（matrix metalloproteinase 3，MMP3）基因結(jié)合得分均大于0.90分。（圖4）

2.4 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證 3個(gè)所選基因的表達(dá)

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

綜合TCGA和GTEx中的食管癌數(shù)據(jù)，可得到食管癌組織182例，正常食管組織286例，綜合其測序數(shù)據(jù)進(jìn)行SPRR3、TRIP13和MMP3基因表達(dá)量的驗(yàn)證，結(jié)果顯示，食管癌組織中SPRR3mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常組織，MMP3、TRIP13mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表4）

表4 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中SPRR 3、TRIP13、MMP 3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表4 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中SPRR 3、TRIP13、MMP 3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組織正常組織（n=286）食管癌組織（n=182）t值P值SPRR3 mRNA 14.32±0.13 10.95±3.15 4.400 0.000 MMP3 mRNA 3.76±0.19 5.58±1.79 4.140 0.000 TRIP13 mRNA 6.64±0.28 8.60±0.65 11.350 0.000

3 討論

食管癌是一種常見的上消化道惡性腫瘤，惡性程度較高，缺乏早期診斷的特異性生物標(biāo)志物，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，預(yù)后較差[20]，食管癌是中國甚至全球發(fā)病率和病死率最高的上消化道惡性腫瘤[1]。因此，探索研究食管癌，特別是ESCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尤為重要，尋找特異性的生物標(biāo)志物對(duì)食管癌的早期診斷及精確治療具有重要意義。

Jiang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNA-218的表達(dá)可以作為食管癌患者早期診斷和臨床評(píng)估的分子標(biāo)志物。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TPX2微管成核因子（TPX2 microtubule nucleation factor，TPX2）基因的表達(dá)與ESCC患者的惡性程度呈正相關(guān)，TPX2基因的表達(dá)越高，惡性程度越強(qiáng)。Otsuka等[23]研究發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白 750（zinc finger protein 750，ZNF750）基因的低表達(dá)與ESCC患者的預(yù)后差密切相關(guān)，因此認(rèn)為，ZNF750基因可以作為ESCC患者預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物。Jin等[24]研究發(fā)現(xiàn)，TAC1基因的甲基化與食管癌患者的預(yù)后差明顯相關(guān)；Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，SPRR3基因可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而減弱ESCC細(xì)胞的致瘤性；TRIP13基因可以調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮原癌基因的作用，TRIP13高表達(dá)與預(yù)后差明顯相關(guān)[26]，而TRIP13在ESCC的研究較少；MMP3基因在ESCC中作為原癌基因發(fā)揮作用，促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和遷移，還可誘導(dǎo)N-精氨酸二元轉(zhuǎn)化酶1（NRD convertase 1，NRD1）基因促進(jìn)ESCC的發(fā)生和發(fā)展[27-29]。

目前，研究多著眼于某一個(gè)單獨(dú)基因，進(jìn)而探討其對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制研究，以期作為特異性的腫瘤診斷治療的生物標(biāo)志物，由于人體基因的數(shù)量和其復(fù)雜性，使單一基因作為腫瘤診斷治療的生物標(biāo)志物顯得有所不足。關(guān)于多個(gè)基因組成一個(gè)基因集作為ESCC診斷治療的生物標(biāo)志物的研究較少，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法獲得SPRR3、TRIP13和MMP3基因組成的一個(gè)基因集，作為ESCC早期診斷和精準(zhǔn)治療的生物標(biāo)志物，旨在為ESCC的預(yù)防和治療提供新的方向和策略。

綜上所述，SPRR3、TRIP13和MMP3基因集可作為分子標(biāo)志物，為食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療提供一定方向。