膽綠素還原酶在抗腫瘤治療中作用的研究進(jìn)展△

周陽(yáng)，劉慧，張華，朱大嶺，劉芳#

1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸內(nèi)科三病區(qū)，哈爾濱150081

2秦皇島市衛(wèi)生學(xué)校教務(wù)科，河北 秦皇島066000

3哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)中心實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶163319

二十世紀(jì)60年代，作為一種將膽綠素轉(zhuǎn)化為膽紅素的關(guān)鍵酶，膽綠素還原酶（biliverdin reductase，BVR）首次被發(fā)現(xiàn)。BVR最初僅被認(rèn)為在血紅素的代謝過(guò)程中發(fā)揮作用，但隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)其在腎癌、食管癌和肺癌等多種腫瘤的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，且其表達(dá)具有明顯的組織特異性，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系密切。此外，BVR在腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的過(guò)程中亦發(fā)揮著重要作用，從而參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。雖然BVR調(diào)控腫瘤的機(jī)制目前已取得一些初步的研究結(jié)果，但尚不為人所知。本文系統(tǒng)闡述了BVR與腫瘤的關(guān)系、調(diào)控腫瘤的具體機(jī)制、在細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的機(jī)制、在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化功能的特性以及作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蛋白質(zhì)合成的機(jī)制，旨在為腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究提供新的思路，為臨床抗腫瘤治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 BVR的結(jié)構(gòu)和功能

BVR是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴酶，在NADPH存在的情況下，可以將膽綠素還原成膽紅素[1]。巰基（sulfhydryl group，SH）是BVR酶功能存在的基礎(chǔ)，作為一種相對(duì)少有的雙重特異性蛋白激酶，BVR既能使絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，又能使酪氨酸磷酸化，因此，其成為蛋白質(zhì)磷酸化的關(guān)鍵酶[2]。BVR具有特征性的功能結(jié)構(gòu)，包括亮氨酸拉鏈DNA序列、核定位序列和核輸出序列。受刺激后，BVR能進(jìn)入細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)膜，與啟動(dòng)子同源序列綁定，發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄因子的作用，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)[3-4]。這些大數(shù)量的多功能序列結(jié)構(gòu)使BVR成為功能信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑中的重要調(diào)節(jié)因子。此外，BVR具有2個(gè)酪氨酸激酶Src同源區(qū)2（Src homology 2，SH2）結(jié)構(gòu)域，SH2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白結(jié)合在多種酪氨酸激酶始動(dòng)的細(xì)胞增殖信號(hào)中發(fā)揮著重要作用。Src家族同源結(jié)構(gòu)域正逐漸成為新的抗腫瘤治療靶點(diǎn)[4]。BVR主要通過(guò)以下3種方式對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用：①作為還原酶；②作為雙特異性激酶；③作為堿性區(qū)-亮氨酸拉鏈（basic region-leucine zipper，bZIP）型轉(zhuǎn)錄因子。因此，基于BVR的多種作用途徑及其蛋白質(zhì)多重結(jié)構(gòu)的特征，其與整個(gè)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系密切。

2 BVR與腫瘤的關(guān)系

在多種酶和細(xì)胞因子的作用下，異常細(xì)胞信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)。早在1999年，Maines等[5]首先采用免疫熒光等方法發(fā)現(xiàn)BVR在腎癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，活化后的BVR定位于細(xì)胞核，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的的異常表達(dá)。隨后，Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)人膽綠素還原酶（human biliverdin reductase，hBVR）在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，并通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)等方法證實(shí)BVR可作為食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物。此外，Hellman等[7]利用患者的新鮮組織標(biāo)本，采用二維凝膠電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析證明BVR可作為聯(lián)合診斷陰道癌的有效分子標(biāo)志物，尤其對(duì)于早期宮頸癌的的篩查有重要意義。這些研究進(jìn)一步驗(yàn)證了BVR在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要地位。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，BVR在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在一定因素下可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。EMT以上皮細(xì)胞失去極性獲得間葉細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)和功能為特征，是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[8]。2008年有研究首先發(fā)現(xiàn)BVR通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了低氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT，是導(dǎo)致慢性腎纖維化從而發(fā)生腎功能衰竭的主要原因[9]。隨后，朱大嶺教授課題組發(fā)現(xiàn)BVR在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，BVR通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT[10]。此外，在肺癌方面，該課題組采用免疫組化、免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot，WB）和si-hBVR等方法證明了BVR能夠介導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的EMT[11]。hBVR在肝癌和皮膚癌等惡性腫瘤中均過(guò)表達(dá)，且與患者的分期和預(yù)后有關(guān)，但在少數(shù)腫瘤中無(wú)表達(dá)[12]，說(shuō)明BVR在腫瘤組織中的表達(dá)具有明顯組織特異性。

3 BVR調(diào)控腫瘤的機(jī)制

3.1 BVR調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路

3.1.1 MAPK信號(hào)通路 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、運(yùn)動(dòng)、分化和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是促進(jìn)多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的經(jīng)典通路[13]。它是一個(gè)從迅速加速纖維肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）到絲裂原活化的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated extracellular signal regulated kinase，MEK）再到MAPK的核心級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ERK是MAPK家族的主要亞族，包括ERK1和ERK2兩個(gè)亞型，是將信號(hào)從細(xì)胞膜傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。研究表明，hBVR對(duì)ERK的激活具有重要意義（圖1a）。胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulinlike growth factor，IGF）-1作為IGF/MAPK通路中的配體可以激活ERK[4]。hBVR是ERK的底物，在BVR過(guò)表達(dá)的情況下，ERK可以與之形成復(fù)合物，并發(fā)揮雙向轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。當(dāng)信號(hào)通路處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，ERK固定于細(xì)胞質(zhì)中；一旦ERK被磷酸化，hBVR可將其轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核[4]。此外，在細(xì)胞核中，hBVR還可使ERK1/2與轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1（ETS-like 1，ELK-1）接近，磷酸化并激活ELK-1，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為[14]。

圖1 BVR調(diào)控腫瘤相關(guān)信號(hào)通路示意圖

3.1.2 PI 3K/AKT信號(hào)通路PI3K/AKT信號(hào)通路是影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的經(jīng)典信號(hào)通路之一[15]。PI3K家族包括許多脂質(zhì)激酶，由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基（p85）和一個(gè)催化亞基（p110）組成。AKT是PI3K重要的下游分子，對(duì)于調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路具有重要作用[16]。BVR可與PI3K-p85相互作用，促進(jìn)AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的產(chǎn)生[17]。BVR結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)SH2結(jié)合位點(diǎn)，包括Y198MKM和Y228LSF，它們是調(diào)控PI3K/AKT通路的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。其中，Y198MKM是PI3K調(diào)控亞基p85的理想結(jié)合位點(diǎn)，而Y228LSF與BVR蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化功能的發(fā)揮關(guān)系密切[18]。此外，BVR作為一種保護(hù)細(xì)胞的信號(hào)蛋白，還可以通過(guò)激活PI3K通路發(fā)揮氧化應(yīng)激的功能。因此，BVR在PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色。

3.1.3 PKC家族與BVR的關(guān)系 蛋白激酶C（protein kianse C，PKC）既是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)因子，參與細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，也是多種信號(hào)通路的關(guān)鍵控制點(diǎn)和連接樞紐[19]。依據(jù)PKC調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)構(gòu)和酶學(xué)特點(diǎn)的不同，PKC家族分為3個(gè)亞組和眾多亞型。其中，PKCδ可作為G蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物在多種信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，是控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及葡萄糖信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[20]。研究表明，BVR可以通過(guò)鋅離子螯合半胱氨酸殘基的機(jī)制結(jié)合至PKC的C1結(jié)構(gòu)域上（圖1b），觸發(fā)PKCδ構(gòu)象發(fā)生改變，調(diào)控其功能發(fā)生變化[21]。研究已證實(shí)，PKCδ在MAPK和PI3K/AKT雙重通路中起著樞紐的作用，發(fā)揮著Cross talk的功能（圖1c）。因此，BVR可通過(guò)調(diào)控PKCδ的活性調(diào)節(jié)此兩條經(jīng)典腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的功能[17]。

3.1.4 BVR、Erk 1/ 2、PKC δ復(fù)合物 有研究顯示，BVR可與Erk1/2、PKCδ形成復(fù)合物，從而激活BVR，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)因子如核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）活性的增加[4]。hBVR含有C盒和D盒序列，其中，C盒序列是hBVR與ERK結(jié)合的關(guān)鍵序列，而D-盒序列是hBVR與PKCδ相互作用的關(guān)鍵序列[14]。因此，在此復(fù)合物中，BVR作為支架，使底物ERK與其激活的PKCδ或MEK接近，不僅提供了蛋白相互作用的平臺(tái)，還起到了維持蛋白質(zhì)活性構(gòu)象的功能。此外，該復(fù)合物還可以利用BVR的抗氧化應(yīng)激作用保護(hù)PKCδ避免被分解，從而抑制細(xì)胞凋亡。因此，通過(guò)此復(fù)合物使BVR發(fā)揮調(diào)控Erk1/2和PKCδ相關(guān)信號(hào)通路的功能，是多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[22]。

3.2 BVR的轉(zhuǎn)錄激活功能

BVR除了磷酸化修飾功能外（圖2a），還具有轉(zhuǎn)錄激活功能。BVR的DNA結(jié)構(gòu)含有亮氨酸拉鏈特征性功能序列，該序列是重要的結(jié)構(gòu)模體，見(jiàn)于多種轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活作用。受刺激后，BVR能進(jìn)入細(xì)胞核與啟動(dòng)子同源序列綁定，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)[3]。研究顯示，激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）啟動(dòng)子序列含有BVR結(jié)合位點(diǎn)，是BVR作為轉(zhuǎn)錄因子直接作用的靶點(diǎn)。AP-1也是亮氨酸zipper蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，其DNA序列含有EMT相關(guān)基因Snail1、Snail2等啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)。因此，BVR可通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活A(yù)P-1調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)[23（]圖2b）。此外，有研究通過(guò)微陣列分析等方法發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的BVR使活化轉(zhuǎn)錄因子 2（activating transcription factor-2，ATF-2）及環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）的編碼基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，刺激腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[24]。

3.3 BVR作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體

BVR廣泛分布于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)耗能的方式將信號(hào)和調(diào)控分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核中，從而發(fā)揮跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[25]。上述研究介紹了BVR在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間轉(zhuǎn)運(yùn)ERK的功能，就是BVR發(fā)揮跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的一個(gè)例子（圖2c）。同樣，BVR還可在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)血紅素，從而在紅細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮作用。血紅素可以與人BVR的C端的7個(gè)氨基酸結(jié)合，共同被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，然后經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活β-珠蛋白和血紅素加氧酶1（Heme oxygenase 1，HO-1）基因。因此，BVR在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)血紅素的功能對(duì)β-珠蛋白和HO-1在紅細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)具有重要意義。

圖2 BVR不同功能的示意圖

3.4 BVR的抗氧化特性

活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的升高可激活信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、代謝及血管生成，加速腫瘤的發(fā)展。因此，ROS水平升高是腫瘤細(xì)胞株的特征。作為BVR的底物和產(chǎn)物，膽綠素和膽紅素是已知的抗氧化劑。首先，膽紅素與谷胱甘肽具有相似的細(xì)胞保護(hù)作用，兩者相輔相成。親水性谷胱甘肽在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮作用，而親脂性的膽紅素則保護(hù)細(xì)胞膜不受損害[26]。其次，膽綠素具有細(xì)胞保護(hù)功能，可在休克和急性肝炎的動(dòng)物模型中，通過(guò)細(xì)胞表面的BVR誘導(dǎo)AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和IL-10表達(dá)，抑制動(dòng)物體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[27（]圖2d）。此外，膽汁色素可在胃癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮其抗突變特性[28]。有研究認(rèn)為，膽汁色素可能對(duì)其他ROS介導(dǎo)的疾病起保護(hù)作用，如動(dòng)脈粥樣硬化與循環(huán)膽紅素濃度呈負(fù)相關(guān)。尤為重要的是，ROS與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，BVR通過(guò)其抗氧化特性抑制腫瘤的發(fā)生，發(fā)揮了細(xì)胞保護(hù)作用[29]。

3.5 BVR多肽作為潛在的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

3種BVR多肽中，肽KYCCSRK能激活BVR激酶的活性，而肽KKRILHC和肽KRNRYLSF均能抑制BVR激酶的活性[30]。其中，抑制性多肽不僅能影響B(tài)VR自身的活性，還能影響一些激酶的活性，如抑制ERK的激活。此外，多肽還可以通過(guò)破壞BVR的支架作用，抑制BVR、MEK1和ERK1/2復(fù)合物的形成（圖2e）。ERK1/2不受控制的激活是惡性腫瘤的特點(diǎn)之一[10]。因此，基于BVR的抑制多肽的治療藥物有望成為抗腫瘤治療的新途徑。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，基于BVR結(jié)構(gòu)的特征性和功能的多樣化，BVR以多種方式參與著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。BVR可以直接或間接調(diào)控兩條經(jīng)典腫瘤相關(guān)信號(hào)通路（MAPK/ERK和PI3K/AKT）的活性；功能上，其不但具有傳統(tǒng)意義上的蛋白磷酸化作用，還具有轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)、抗氧化以及作為多肽調(diào)節(jié)底物的特性。因此，基于BVR在腫瘤調(diào)控方面的多樣性和重要性，并隨著對(duì)其探索得不斷深入，有望成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。