溫水浸種對杜仲種子萌發(fā)過程中保護酶活性及內(nèi)源激素含量變化的影響

王 寧 董瑩瑩 袁美麗 王亞楠 曾勝蘊

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，洛陽 471023；2.洛陽市城市管理局，洛陽 471002；3.洛陽市隋唐城遺址植物園，洛陽 471002)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)落葉喬木，中國特有名貴藥材樹種，國家二級保護植物，廣泛分布于我國亞熱帶至溫帶的湖南、貴州、四川、河南、山西等地[1]。我國對杜仲認識及利用的記載至少已有2 000多年歷史，明代《本草綱目》更是集前朝歷代之經(jīng)驗，對杜仲的認識系統(tǒng)完備化[2]?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)也已發(fā)現(xiàn)了杜仲珍貴的藥用價值。如杜仲中的綠原酸等酚酸類物質(zhì)以及環(huán)烯醚萜類物質(zhì)對肝功能及肝組織再生具有明顯的促進作用[3～6]。杜仲的次生代謝產(chǎn)物桃葉珊瑚甙、松脂素二糖甙及綠原酸等，是降血壓藥的主要成分，丁香素二葡萄糖甙具有增強記憶力、安定鎮(zhèn)靜以及降低膽固醇等功效[7～8]。除了擁有較高的藥用價值，杜仲還是世界上重要的膠源植物。杜仲膠在國際上被稱為巴拉塔膠或古塔波膠[9]，作為天然橡膠的同分異構(gòu)體，已成為天然橡膠最佳的天然高分子材料替代品[10～11]。此外，杜仲也是較好的用材樹種，并作為優(yōu)良觀賞植物被廣泛應(yīng)用于城市園林綠化。

播種育苗是杜仲苗木生產(chǎn)的主要方式之一，但至今有關(guān)其種子休眠及萌發(fā)的相關(guān)研究并不多。林堅[12]、申延[13]等研究認為，對萌發(fā)溫度的敏感性及來自果皮膠質(zhì)的機械束縛是限制和阻礙杜仲種子萌發(fā)而導(dǎo)致其休眠的主要原因。吳楚材等[14]研究發(fā)現(xiàn)，混沙濕藏及20～25℃的溫度最適宜杜仲種子發(fā)芽。鄒仁雙[15]研究得出，50℃溫水、赤霉素等植物生長調(diào)節(jié)劑浸種均能明顯提高杜仲種子發(fā)芽率。至今為止，有關(guān)杜仲種子萌發(fā)進程中有關(guān)酶活性及內(nèi)源激素含量變化的研究尚未見有報道。種子萌發(fā)過程中伴隨著如呼吸代謝作用、貯藏物質(zhì)的代謝及轉(zhuǎn)化等一系列復(fù)雜而有序的生理變化，探討參與這些生理活動的酶及內(nèi)源激素的變化，可為杜仲種子萌發(fā)及出苗相關(guān)機理的研究提供參考，同時也為種子萌發(fā)不同階段采取有效的針對措施，從而為提高其出苗率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年10月，供試種子來源于河南省伊川縣杜仲種植基地。試驗在河南科技大學(xué)園林植物實驗室進行。試驗前將種子倒入盛有自來水的盆中，充分攪拌后靜止8～10 min，除去浮種，將沉底種子撈出并清水洗凈，晾干備用。

1.2 方法

1.2.1 種子萌動處理

參照鄒仁雙[15]研究，對杜仲種子進行室溫(CK)、40℃、50℃、60℃和70℃ 5個梯度恒溫條件下(浸泡燒杯置于水浴鍋內(nèi))24 h的浸種處理。將浸泡過并已晾干的種子進行5% NaClO溶液中消毒10 min，隨后蒸餾水沖洗3次，濾紙吸去種子表面多余水分。采用培養(yǎng)皿濾紙法進行萌發(fā)試驗，將處理好的種子均勻排列在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)內(nèi)，10?！っ?1，每處理5次重復(fù)，置于晝/夜為25℃/20℃及光暗比為12 h/12 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。萌發(fā)試驗共進行15 d。每天統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)(胚根長度為種子長度的1/2視為萌發(fā))，并定時補充蒸餾水保持濾紙濕潤。試驗結(jié)束后統(tǒng)計種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢。其中：

發(fā)芽率(Germination Rate,GR/%)=(萌發(fā)種子數(shù)量/供試種子數(shù)量)×100%

(1)

發(fā)芽勢(Germination Energy,GE/%)=(從開始至發(fā)芽高峰的萌發(fā)種子數(shù)量/供試種子數(shù))×100%

(2)

1.2.2 萌發(fā)生理生化指標測定

分別取室溫(CK)和50℃溫水浸種處理種子在培養(yǎng)的第0(CK)、3、6、9、12、15 d取樣進行相關(guān)生理指標測定。參照參考文獻[16～17]，氮藍四唑光還原法測SOD活性，愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。此外，采用酶聯(lián)免疫法[16](Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)測定內(nèi)源激素赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)的含量，并分別計算GA3/ABA、IAA/ABA和ZR/ABA的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件對種子萌發(fā)、生理及內(nèi)源激素等指標進行單因素方差分析，Duncan’s法檢驗其差異顯著性。利用Excel制作圖表。統(tǒng)計值以平均值±標準誤差(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫水浸種對杜仲種子萌發(fā)的影響

從圖1中可知，與室溫浸種處理相比(CK)，溫水浸種能一定程度上提高杜仲種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢，但隨著水溫的持續(xù)升高發(fā)芽率及發(fā)芽勢又呈逐漸下降的變化。其中，以50℃溫水浸種處理的發(fā)芽率及發(fā)芽勢為最高，分別達到84.67%和43.50%，且均顯著高于CK(P<0.05)。

圖1 不同浸種溫度對杜仲種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢的影響 不同字母表示不同溫度處理間差異顯著，下同。Fig.1 Germination rate and germination energy of E.ulmoides by soaking seed at different temperature Different letters indicate significant different among different temperature treatment(P<0.05),the same as below.

2.2 杜仲種子萌發(fā)過程中生理特性的影響

2.2.1 保護酶活性及MDA含量

從圖2可知，萌發(fā)進程中，杜仲種子內(nèi)SOD及POD活性均呈不斷增加的變化，且從第3天開始，50℃溫水浸種處理中的SOD及POD活性均明顯高于室溫浸種處理。至第3天時，50℃溫水浸種處理的SOD活性與CK差異顯著，而室溫處理則在第6天時與CK差異顯著(P<0.05)；50℃溫水浸種處理的POD活性在第3天時與CK差異顯著，而室溫處理則在第15天時與CK差異顯著(P<0.05)。

圖2 杜仲種子萌發(fā)過程中SOD及POD活性的變化Fig.2 The change of SOD and POD activity in the germination process of E.ulmoides seeds

杜仲種子內(nèi)MDA含量隨萌發(fā)進程呈持續(xù)下降的變化(見圖3)。室溫浸種處理的MDA含量在第9天時與CK差異顯著，而50℃溫水浸種處理則在第3天時與CK差異顯著(P<0.05)。從第3天開始，50℃溫水浸種處理中的MDA含量均明顯低于室溫處理。

圖3 杜仲種子萌發(fā)過程中MDA含量的變化Fig.3 The change of MDA content in the germination process of E.ulmoides seeds

2.2.2 內(nèi)源激素

2.2.2.1 內(nèi)源激素含量

從圖4可看出，萌發(fā)進程中，50℃溫水及室溫浸種處理中杜仲種子內(nèi)源GA3、IAA和ZR含量均呈不斷增加的變化，而ABA含量則呈持續(xù)下降的變化。

圖4 杜仲種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量的變化Fig.4 Changes of endogenous hormone contents in the germination process of E.ulmoides seeds

圖5 杜仲種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量比值的變化Fig.5 The proportion of endogenous hormone contents in the germination process of E.ulmoides seeds

其中，50℃溫水浸種處理種子內(nèi)源GA3、IAA和ZR含量均在萌發(fā)的第3天時較CK增加達到顯著水平(P<0.05)；而室溫浸種處理種子內(nèi)源GA3含量至第12天時與CK差異顯著(P<0.05)，內(nèi)源IAA和ZR含量則均在第9天時與CK差異顯著(P<0.05)。50℃溫水浸種處理種子內(nèi)源ABA含量第3天時較CK下降達到顯著水平(P<0.05)；而室溫浸種處理種子內(nèi)源ABA含量至第6天時與CK差異顯著(P<0.05)。

2.2.2.2 內(nèi)源激素含量比

從圖5可知，萌發(fā)進程中杜仲種子內(nèi)源GA3/ABA、IAA/ABA及ZR/ABA值均呈持續(xù)增加的變化。其中50℃溫水浸種處理種子內(nèi)源GA3/ABA、IAA/ABA及ZR/ABA值均在至第3天時與CK差異達到顯著水平(P<0.05)，而室溫浸種處理種子內(nèi)源GA3/ABA值在第12天時與CK差異顯著，IAA/ABA及ZR/ABA值則均在第9天時與CK差異顯著(P<0.05)。此外，從第3天開始，50℃溫水浸種處理的GA3/ABA、IAA/ABA及ZR/ABA值均明顯高于室溫浸種處理。

3 討論

種子的休眠及萌發(fā)是植物維持生存及適應(yīng)環(huán)境變化的重要特征[18～19]。種子的破眠及萌發(fā)進程中，內(nèi)源激素通過調(diào)節(jié)一系列蛋白及酶的代謝，對種子內(nèi)各種生理變化做出反應(yīng)，進而調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)。

3.1 溫水浸種對杜仲種子萌發(fā)的影響

適宜的溫水浸泡有利種子的破眠及萌發(fā)[20～22]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同水溫的浸種處理一定范圍內(nèi)均能不同程度提高杜仲種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢。與CK相比，隨著浸種水溫的增加，發(fā)芽率及發(fā)芽勢均呈先升后降的變化趨勢。溫水浸種可以一定程度上促進種子萌發(fā)，這與其軟化種皮、增加種皮透性有關(guān)，而之后隨著水溫的持續(xù)升高，種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢又均呈下降的變化，這可能是由于已進入吸水膨脹期的種子，依然處于水溫較高的環(huán)境中可能對種胚造成一定的傷害，以至部分種子死亡，最終導(dǎo)致發(fā)芽率及發(fā)芽勢的下降。此結(jié)果與蒙古黃芪(AstragalusmembranaceusBge. var)[21]、苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)和苦馬豆(Swainsoniasalsula(Pall.) DC.)[22]的研究結(jié)論相符，也與鄒仁雙[15]的研究結(jié)論一致。

3.2 杜仲種子萌發(fā)過程中保護酶活性及內(nèi)源激素含量變化

3.2.1 保護酶活性及MDA含量變化

MDA是植物質(zhì)膜受傷害程度的重要反映指標，而膜系統(tǒng)的變化則會對種子生活力造成一定影響[27]。本研究中，50℃溫水浸種處理中杜仲種子內(nèi)MDA含量明顯低于室內(nèi)浸種處理，且隨萌發(fā)進程呈不斷下降的變化。由此表明，50℃溫水浸種處理由于提高了種子內(nèi)保護酶活性，從而減輕了質(zhì)膜氧化損傷程度，致使MDA含量的持續(xù)下降，最終達到促進種子萌發(fā)的效果。

3.2.2 內(nèi)源激素含量的變化

種子萌發(fā)與其內(nèi)源激素含量的變化密切相關(guān)，各種激素能夠啟動種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的分解及合成并最終誘導(dǎo)種子的萌發(fā)[28]。在有關(guān)內(nèi)源激素對種子萌發(fā)及萌發(fā)調(diào)控的研究中，最為經(jīng)典的是1975年Khan提出的“三因子學(xué)說”[29]，即萌發(fā)抑制物ABA與萌發(fā)促進物GA3、CTK之間的相互作用決定著種子的休眠及萌發(fā)。GA3通過提高各種酶活性加速種子內(nèi)部物質(zhì)的分解與合成，從而促進種子的萌發(fā)[30]。而ABA則具有拮抗GA3的作用，通過抑制核酸的正常代謝及干擾核糖核酸的合成，造成種子不能進行正常的代謝活動，最終導(dǎo)致種子的休眠[31～32]。本研究中，50℃溫水浸種處理種子內(nèi)源GA3含量明顯高于室溫浸種處理，這可能是由于溫水浸種造成種子內(nèi)部更多束縛態(tài)GA3逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，最終導(dǎo)致了內(nèi)源GA3含量的增加。而50℃溫水浸種處理種子內(nèi)源ABA含量卻明顯低于室溫浸種處理，且隨萌發(fā)進程呈不斷下降的變化。由此表明，溫水浸種處理在提高種子內(nèi)源GA3增加的同時，并降低了內(nèi)源ABA含量，從而促使種子朝向有利于萌發(fā)的方向發(fā)展。IAA與種子休眠的關(guān)系存在不同的研究結(jié)論。有的研究認為，IAA對種子休眠的解除具有促進作用[33]，但也有研究認為IAA含量與種子休眠解除的關(guān)系不大[34]。ZR對種子萌發(fā)抑制物具有拮抗作用，一定程度上與種子休眠性呈負相關(guān)[35]。本研究中，50℃溫水浸種處理種子內(nèi)源IAA及ZR含量均高于蒸餾水處理，再次表明溫水浸種提高了種子內(nèi)促進種子萌發(fā)的內(nèi)源激素含量，從而有利杜仲種子萌發(fā)。

相對于單一內(nèi)源激素，不同激素間的平衡變化對種子休眠和萌發(fā)具有更重要意義，尤其是促進與抑制生長激素之間的比例[18,36]。本研究中，50℃溫水浸種處理杜仲種子內(nèi)源GA3/ABA、IAA/ABA和ZR/ABA值均隨萌發(fā)進程呈不斷增加的變化，且均明顯高于室溫浸種處理，這表明溫水浸種處理在提高種子內(nèi)促進生長激素含量的同時，降低了抑制生長內(nèi)源激素的含量，最終促進杜仲種子的萌發(fā)。