毛竹釋放揮發(fā)物對空氣負(fù)離子及微生物的影響

呂嘉欣，王 翔，項亨旺，韋賽君，王 彬，高 巖，張汝民

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江杭州311300；2.浙江省森林資源監(jiān)測中心，浙江杭州310020；3.亨旺生態(tài)旅游發(fā)展有限公司，浙江德清313200）

植物生長過程中除了通過根系分泌或雨水淋洗葉片向土壤中增加他感化合物外，還會通過花、葉或其他營養(yǎng)器官釋放揮發(fā)性有機(jī)氣體（Volatile Organic Compounds，VOCs）［1］。植物VOCs具有多種生理生態(tài)功能，在凈化空氣、抑菌殺菌、人體保健等方面具有重要價值［2］。香茅草（Cymbopogoncitratus）及紫蘇（Perilla frutescens）釋放的檸檬醛、芳樟醇、大根香葉烯等萜類化合物不但會改變大氣的化學(xué)組成，還會對周圍生物產(chǎn)生影響［3－6］。謝占芳［7］發(fā)現(xiàn)8種菊花（Dendranthemamorifolium）釋放的VOCs對金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、白色念珠菌（CandidaAlbicans）等均有不同程度的抑制作用。孫和龍［8］通過活體實驗，發(fā)現(xiàn)壬醛可作為活體抑菌劑，對番茄青霉和灰霉具有明顯的抑制效果。Fadil等［9］研究發(fā)現(xiàn)百里香（Thymusvulgaris）和香桃木（Myrtuscommunis）精油對鼠傷寒沙門氏菌具有協(xié)同抑菌作用。佟棽棽［10］對迷迭香（Rosmarinusofficinalis）揮發(fā)性香氣研究發(fā)現(xiàn)其中的樟腦和香樟醇等可作為重要的抗抑郁成分。植物VOCs中大部分是可揮發(fā)的中性氣體分子，當(dāng)濃度越高時，受Lenard效應(yīng)（噴桶效應(yīng)）的影響，可產(chǎn)生較多的空氣負(fù)離子（Negative air ion，NAI），從而增加NAI的數(shù)量［11］。NAI具有較高的生態(tài)意義，它的形成與植物自身及周圍環(huán)境（溫度、濕度等）均具有密切關(guān)系［12］。研究表明，大氣中正離子通常具有害作用，而空氣負(fù)離子作為活性氧，生物活性高、還原性強(qiáng)，能夠破壞細(xì)菌、病毒等的屏障及酶的活性，從而抑制細(xì)菌和真菌等微生物的生長［13］、減少微生物氣溶膠的數(shù)量。因此，NAI濃度是生態(tài)環(huán)境和空氣質(zhì)量評價體系中的重要指標(biāo)之一。

目前，有關(guān)毛竹（Phyllostachysedulis）的研究主要集中在光合特性［14］、糖代謝［15］、非生物脅迫［16］、基因組鑒定與表達(dá)分析［17］等方面，而對其林內(nèi)不同季節(jié)揮發(fā)物對微生物綜合影響研究較少。因此，研究選取毛竹為對象，測定了毛竹葉片釋放的VOCs和不同毛竹林內(nèi)空氣VOCs的組分與含量、林內(nèi)空氣負(fù)離子和微生物濃度，探討了毛竹林VOCs對于抑菌、凈化空氣及人體保健的作用，為毛竹作為森林康養(yǎng)建設(shè)樹種提供理論依據(jù)。

1 研究地概況

研究地位于浙江省湖州市德清縣西部莫干山，其地理位置為119°52′E、30°36′N，屬亞熱帶氣候，四季分明，雨量充沛，年平均氣溫13.3℃，年降水量1 893 mm，年均相對濕度81%，年均日照數(shù)1 407.8 h。擁有93.5%的綠化覆蓋率，植被主體為毛竹。

2 材料及方法

2.1 試驗材料

選取長勢良好、無病蟲害、無機(jī)械損傷的毛竹為研究對象，其樹齡為2 a，胸徑18 cm，高約15 m左右。毛竹林為純林，土壤類型為紅黃壤，郁閉度0.7－0.8。對照地林緣較空曠，無樹木影響。

2.2 VOCs采集及分析

單株VOCs采集：2019年5月選擇晴朗無風(fēng)的天氣，于上午9∶00－11∶00使用QC-2型大氣采樣儀采用動態(tài)頂空氣體循環(huán)法采集毛竹單株VOCs。采樣選擇毛竹中冠層向陽葉片，使用塑料袋將枝葉包裹，采樣儀一端用聚四氟乙烯管與塑料袋連接，吸附管插入塑料袋與采樣儀另一端相連，形成閉合回路。氣體循環(huán)流量為100 mL·min－1，采氣時間1 h。根據(jù)樹木平均高度采用5點法選擇5株毛竹，每株作為一個獨立實驗，采集完畢后將袋內(nèi)葉片剪下，帶回實驗室烘干后稱重。

空氣VOCs采集：于2019年5月、8月和11月上午10∶00采用開放式采樣法，在距地面1.5 m處采集林內(nèi)空氣VOCs。用聚四氟乙烯管將吸附管連接于采樣儀進(jìn)氣口，氣體流量為100 mL·min－1，采氣時間1 h，共選擇5個采樣點，每個地點作為1個獨立實驗，共重復(fù)5次。

GC與MS條件：參照GAO等［18］方法設(shè)置GC-MS條件。通過TDS-GC-MS技術(shù)分析，獲得VOCs的總離子流量色譜圖后，利用NIST 2008譜庫查詢，以色譜峰的峰面積計算相對含量，并兼顧色譜保留時間，結(jié)合手工檢索定性。

2.3 空氣負(fù)離子的測定

使用翼鬃麒科技有限公司研發(fā)的YZQ-308A森林康養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)，分別在春、夏、秋季竹林與林緣選擇5個采樣點，在高度1.5 m處測定空氣負(fù)離子濃度，每個采樣點監(jiān)測12 h（6∶00～18∶00），每2 min收集一組數(shù)據(jù)，選擇5組數(shù)據(jù)取平均值。

2.4 培養(yǎng)基的制備

按照肖明［19］的方法配制細(xì)菌培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）、真菌培養(yǎng)基（馬丁式培養(yǎng)基）和放線菌培養(yǎng)基（淀粉瓊脂培養(yǎng)基）。在無菌條件下制備單體基質(zhì)（羅勒烯、乙酸、癸醛和葉醇；sigma公司生產(chǎn)），在每個標(biāo)準(zhǔn)單體中加入2滴吐溫－80，用純水中稀釋100倍、200倍和1 000倍濃度，與培養(yǎng)基混合，單體∶培養(yǎng)基＝1∶9。

2.5 微生物的采集

采用自然沉降法［18］，分別于春、夏、秋季的上午10∶00在毛竹林內(nèi)及林緣各設(shè)3個采樣點，每個采樣點重復(fù)5次，將帶有不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿置于離地1.2～1.5 m高的平板支架上，打開培養(yǎng)皿蓋，采集空氣中自然漂浮的微生物（細(xì)菌、真菌和放線菌）。培養(yǎng)基在空氣中暴露10 min后，將培養(yǎng)皿封好后帶回實驗室置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌、真菌、放線菌菌落統(tǒng)計分別在培養(yǎng)24、48和72 h后進(jìn)行。在林緣進(jìn)行單體微生物的收集，收集方法和培養(yǎng)方法與林內(nèi)一致。

N為培養(yǎng)皿中菌落平均數(shù)（個）；A為培養(yǎng)皿的面積（cm2）；T為打開培養(yǎng)皿皿蓋的時間（min）。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用Origin 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。統(tǒng)計方法采用One-Way ANOVA，進(jìn)行Tukey多重比較（P＜0.05）。

3 結(jié)果與分析

3.1 毛竹單株揮發(fā)物成分分析

對毛竹活體葉片進(jìn)行TDS-GC-MS分析（圖1與表1），扣除空氣本底雜質(zhì)后，從中共檢測到35種化合物，主要有醛類、酯類、醇類和萜烯類。醛類物質(zhì)有8種，約占總VOCs的26.2%，其中主要物質(zhì)有壬醛（8.2%）、癸醛（5.6%）和辛醛（4.2%）等；酯類約占總VOCs的21.9%，包括薄荷醇水楊酸酯（10.0%）、水楊酸辛酯（6.5%）、6-癸內(nèi)酯（4.9%）和乙酸丁酯（0.6%）；醇類物質(zhì)有9種，占總VOCs的18.4%，主要物質(zhì)有正辛醇（5.6%）、葉醇（4.1%）和反式-3-己烯-1-醇（1.8%）等；萜烯類物質(zhì)共8種，占總VOCs的16.6%，其中主要物質(zhì)有長葉烯（5.8%）、羅勒烯（3.7%）和羅漢伯烯（3.0%）等。除上述主要物質(zhì)外，還含有2種酸類物質(zhì)，其中乙酸含量較高，約占總VOCs的5.5%。

圖1 毛竹單株VOCs總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of Ph．edulis VOCs

表1 毛竹單株VOCs成分分析Tab.1 Analysis of VOCs composition of individual Ph．edulis

3.2 毛竹林內(nèi)空氣揮發(fā)物季節(jié)變化分析

對不同季節(jié)毛竹林內(nèi)植物VOCs與林緣相比（圖2與表2）發(fā)現(xiàn)春、夏、秋季毛竹林內(nèi)VOCs釋放量與種類均高于林緣。不同季節(jié)竹林內(nèi)VOCs種類和相對含量存在差異，主要表現(xiàn)為春、夏季種類多，相對含量高，秋季種類少，相對含量低。春季共鑒定出6類19種化合物，其中芳香化合物有7種，占VOCs總量的36.8%，主要物質(zhì)為對二氯苯（12.3%）、甲苯（8%）；烷烴類物質(zhì)2種，占VOCs總量的17.7%，主要為有十五烷（16.1%）；酸類有3種占VOCs總量的20.7%，主要有乙酸（11.7%）、異辛酸（5.7%）等；醛類有5種占VOCs總量的13.5%，主要有壬醛（4.2%）、癸醛（3.6%）、辛醛（1.9%）等；酯類物質(zhì)有乙酸丁酯1種占VOCs總量的8.7%；醇類物質(zhì)為2-乙基己醇，占比（3.7%）；萜烯類物質(zhì)為雪松烯，占比2.5%。夏季共鑒定出7類22種化合物，其中烷烴類物質(zhì)1種，為十五烷（4.0%）；芳香化合物有7種，占VOCs總量的29.1%，主要物質(zhì)為甲苯（1.7%）、萘（4.5%）等；酯類物質(zhì)有乙酸丁酯1種占VOCs總量的2.1%；醛類有7種占VOCs總量的24.2%，主要有壬醛（6.1%）、癸醛（6.2%）等；酸類有2種，主要為乙酸，占VOCs總量的16.2%；醇類物質(zhì)為2-乙基己醇（4.6%）1種；萜烯類物質(zhì)為α-蒎烯（1.1%）、柏木烯（2.8%）、雪松烯（3.7%），共占比7.6%。秋季共鑒定出4類8種化合物，其中芳香化合物有3種，主要為甲苯，占VOCs總量的18.7%；烷烴有1種，為十五烷（18.5%）；醛類有3種，占VOCs總量的55.4%，為壬醛（26.7%）、癸醛（21.9%）、苯甲醛（6.8%）；酸類物質(zhì)有1種，為乙酸（11.8%）。

圖2 不同季節(jié)毛竹林VOCs成分總離子流圖Fig.2 Total ion diagram of VOCs of Ph．edulis forest in different seasons

表2 不同季節(jié)毛竹林空氣VOCs成分變化Tab.2 Air volatile components of Ph．edulis forest in different seasons

3.3 空氣負(fù)離子的季節(jié)變化

分別對春、夏、秋季的林內(nèi)與林緣處進(jìn)行空氣負(fù)離子統(tǒng)計，結(jié)果見圖3：竹林內(nèi)NAI有明顯的季節(jié)變化且濃度遠(yuǎn)高于林緣。竹林夏季分別比春季和秋季增加了47.8%和72.3%（P＜0.05）；林緣夏季分別比春季和秋季增加了40.4%和69.9%（P＜0.05）；春、夏、秋季毛竹林比林緣分別增加了61.9%、84.9%和70.3%（P＜0.05）。

圖3 毛竹林空氣負(fù)離子季節(jié)變化Fig.3 Seasonal variation of air anion in Ph．edulis forest

3.4 毛竹林內(nèi)空氣微生物季節(jié)變化

如圖4所示：春、夏、秋季的實地監(jiān)測表明，林內(nèi)微生物濃度在不同季節(jié)具有一定的動態(tài)變化。不同季節(jié)林內(nèi)細(xì)菌濃度均低于林緣。夏季林內(nèi)細(xì)菌濃度與春季相比無明顯差異，與秋季相比減少了30.1%（P＜0.05）；秋季林緣細(xì)菌濃度比春、夏季分別增加了30.3%和15.4%（P＜0.05）；春、夏、秋季林緣細(xì)菌濃度比毛竹林分別增加了32.9%、49.0%和20.2%（P＜0.05，圖4A）；夏季林內(nèi)真菌濃度與春季相比差異不顯著，與秋季相比減少了26.9% （P＜0.05）；秋季林緣真菌濃度比春、夏季增加了44.1%和16.4%（P＜0.05）；春、夏、秋季林緣真菌濃度比林內(nèi)分別增加了37.7%、36.8%和16.4%（P＜0.05，圖4B）；夏季林內(nèi)放線菌濃度與春、秋季減少了22.2%、46.2%（P＜0.05）；秋季林緣放線菌濃度與春季相比無明顯差異，與秋季相比減少了23.5%（P＜0.05）；春、夏、秋季林緣放線菌濃度比林內(nèi)分別增加了44.4%、85.7%和30.8%（P＜0.05，圖4C）。

圖4 毛竹林微生物季節(jié)變化Fig.4 Seasonal variation of microbe in Ph．edulis forest

3.5 單體對空氣微生物的影響

選擇毛竹單株釋放量較高的羅勒烯、乙酸、癸醛、葉醇，將以上4種物質(zhì)的單體添加進(jìn)培養(yǎng)液中，觀察微生物的生長狀況，結(jié)果見圖5。隨含量增多，4種單體對微生物的抑制作用增強(qiáng)。0.1%的羅勒烯對細(xì)菌抑制作用顯著，抑制率為19.9%（P＜0.05）；0.5%的羅勒烯，對真菌與放線菌有顯著抑制作用，抑制率分別為22.9%、33.3%（P＜0.05）。0.1%的乙酸對細(xì)菌抑制作用顯著，抑制率為32.0%（P＜0.05）；0.5%的乙酸對真菌與放線菌抑制作用顯著，抑制率為26.9%、36.4%（P＜0.05）。0.1%的癸醛對真菌抑制作用顯著，抑制率為33.6%（P＜0.05）；0.5%的癸醛對細(xì)菌與放線菌抑制作用顯著，抑制率為42.4%、22.3%（P＜0.05）。0.1%的葉醇對細(xì)菌抑制作用顯著，抑制率為32.0%（P＜0.05）；0.5%的葉醇對真菌與放線菌抑制作用顯著，抑制率為21.7%、30.3%（P＜0.05）。

圖5 單體對空氣微生物的影響Fig.5 Effect of monomer concentrations on the microorganisms

4 討論

植物釋放VOCs的種類與含量不僅與植物的遺傳特性有關(guān)，而且與植物所處的生長發(fā)育狀態(tài)及外部環(huán)境密切相關(guān)［20］。禾本科（Gramineae）、含羞草科（Mimosaceae）、?？疲∕oraceae）和楊柳科（Salicaceae）中的多數(shù)種屬為異戊二烯的釋放者，樺木科（Betulaceae）、松科（Pinaceae）和槭樹科（Aceraceae）等多釋放萜烯類［21］。郭慧媛等［22］研究發(fā)現(xiàn)2年生毛竹VOCs中含有大量的2-己烯醛、庚醛、壬醛、癸醛、辛醇等，這與本研究結(jié)果一致。光照與溫度是植物釋放VOCs最為密切的環(huán)境因子［23］，花圣卓等［24］發(fā)現(xiàn)5種典型森林樹種的萜烯類化合物釋放量隨光照的升高而增加，胡立香等［25］發(fā)現(xiàn)白皮松VOCs釋放高峰出現(xiàn)在夏季。研究發(fā)現(xiàn)與林緣相比，毛竹林特有的化合物為醛類與萜烯類，且VOCs總釋放量在夏季達(dá)到最大，這可能是因為夏季光照較強(qiáng)，氣溫達(dá)到一年中最高，植物進(jìn)入生長旺盛期，體內(nèi)化合物合成速率加快，導(dǎo)致葉片釋放的VOCs含量在夏季達(dá)到最高［26］。除此之外，VOCs的合成與釋放還受各自合成酶活性的影響［27］，夏季酶活性的增強(qiáng)引起次生代謝物合成速率的增加、光合速率增強(qiáng)，為植物VOCs提供充足的碳源及還原力，同時，強(qiáng)烈的蒸騰作用也為VOCs的擴(kuò)散創(chuàng)造了有利條件［28］。

VOCs在空氣對流層的大氣化學(xué)過程中起著十分重要的作用，它影響著大氣的氧化平衡及氣溶膠的形成，空氣負(fù)離子就是氣溶膠粒子的一種。NAI是衡量空氣清潔度與生態(tài)環(huán)境的重要指標(biāo)，除自然能源輻射形成外，植物光合作用的光電效應(yīng)及葉片的尖端放電也能有效增加NAI濃度［12］。吳楚材等［29］發(fā)現(xiàn)瀑布、水域和植物密度對空氣負(fù)離子濃度的貢獻(xiàn)值最大，從高到低依次為瀑布、水域、草地、其他景觀。本研究發(fā)現(xiàn)，NAI濃度季節(jié)變化與VOCs季節(jié)變化一致，均為夏季＞春季＞秋季且林內(nèi)濃度高于林緣，這與周德平［30］等研究結(jié)果一致。其原因可能是夏季降水增多，太陽紫外線強(qiáng)烈，毛竹葉片的尖端效應(yīng)使得NAI的濃度升高［31］。另有研究表明，酸與酯類與NAI濃度呈顯著正相關(guān)［32］，夏季毛竹VOCs中的酸類與酯類釋放量達(dá)到一年內(nèi)的最大峰值，對NAI的釋放及生存起到一定的增加效應(yīng)。

植物釋放的VOCs具有重要的生態(tài)學(xué)功能，參與植物直接與間接防御反應(yīng)，同時具有防止病菌及微生物的感染、減少或殺死空氣微生物的作用［2］。VOCs活性主要取決于其疏水性，當(dāng)其與菌絲細(xì)胞膜的脂質(zhì)層相互作用后，導(dǎo)致菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生修飾及改變，還會引起細(xì)胞膜的通透性改變，繼而引起細(xì)胞成分的泄露，起到抑制微生物的作用［33］。陸志科等［34］測定毛金竹（Phyllostachysnigra）、毛竹等9種竹子在不同季節(jié)活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)7月采摘的竹葉提取物比5月的抗霉菌、酵母菌的活性更高。本研究結(jié)果顯示夏季毛竹林的抑菌效果更明顯，且3個季節(jié)的竹林內(nèi)抑菌率均高于林緣。已有研究顯示，2-己烯醛、苯甲醛和癸醛等醛類有明顯的抑制微生物的作用［19，35］，毛竹葉片中含有大量黃酮類物質(zhì)，被證實對微生物有顯著的抑制作用［36］，竹葉中的酸類及苯酚類化合物對細(xì)菌、真菌及酵母菌等的抑制效果也較強(qiáng)［37］。為了進(jìn)一步探索毛竹VOCs中的具體抑菌物質(zhì)，選取毛竹單株釋放組分較高的羅勒烯、乙酸、癸醛及葉醇來進(jìn)行單體抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)4種單體對微生物生長均有顯著抑制作用，羅勒烯、乙酸與葉醇對細(xì)菌有顯著的抑制作用，癸醛對真菌有顯著的抑制作用。所以，上述4種化單體可能是毛竹VOCs中主要的抑菌物質(zhì)，毛竹的抑菌作用可能是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。

綜上所述，毛竹釋放的VOCs以醛類、酯類、醇類和萜烯類為主，夏季竹林內(nèi)的VOCs釋放量及NAI濃度達(dá)到最高，微生物濃度明顯降低，癸醛、乙酸、羅勒烯、葉醇可能是葉片釋放的的主要抑菌物質(zhì)。上述結(jié)果為進(jìn)一步探討毛竹林對于凈化空氣、人體保健的作用及毛竹作為森林康養(yǎng)建設(shè)樹種提供理論依據(jù)。