雙水相–SPE–TFA–GC/MS 測定煙草中 糖苷類潛香物質(zhì)方法的建立

彭振興，郭東鋒，王正剛，姚忠達(dá)，張福建，牛慧偉

(1.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，安徽 合肥 230088；2.中國煙草總公司職工進(jìn)修學(xué)院，河南 鄭州 450000)

煙草中的糖苷是一類由單糖或低聚糖的羥基氨基硫羥基和另一分子中的半縮醛羥基等失水而產(chǎn)生的化合物[1]，是煙葉生長過程中形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]。糖苷相對(duì)分子質(zhì)量較大，沸點(diǎn)較高，香氣較少或本身沒有香氣，但在卷煙燃吸過程中經(jīng)高溫加熱或燃燒裂解能釋放出香氣香味[3-4]。GREEN等[5]發(fā)現(xiàn)，煙草中的非揮發(fā)性香氣前體以糖苷形式存在，水解釋放出3-羥基二氫大馬酮和3-酮基紫羅蘭醇等香氣物質(zhì)。用氣相色譜法、高效液相色譜法對(duì)烤煙中的香氣成分及糖苷成分進(jìn)行分析，但一次只能分離鑒定出很少幾種成分[6-12]。煙草中糖苷類物質(zhì)含量較低，且與水溶性糖、游離態(tài)香味物質(zhì)、生物堿和色素等的性質(zhì)相近[13-17]，較難獲得純凈的標(biāo)準(zhǔn)樣品。劉百戰(zhàn)等[18]用甲醇提取煙樣中糖苷成分，采用非離子型大孔樹脂(AB-8) ，選用乙醚－正己烷萃取，使煙草中的糖苷與可溶性糖、氨基酸、有機(jī)酸、游離香味成分分離。田振峰等[19]用甲醇連續(xù)超聲萃取，再用正己烷-乙醚萃取后得到含有糖苷類物質(zhì)的溶液，用二氯甲烷萃取，經(jīng)酸洗、堿洗，得到有機(jī)層，干燥后即為糖苷精提物。胡雅琴等[20]用甲醇重復(fù)提取煙樣，過DM-401 層析柱，且用二氯甲烷萃取，采用蒸餾萃取(SDE)法分離煙草樣品中的香味成分。筆者嘗試建立雙水相提取-固相萃取(SPE)-三氟乙酰衍生化(TFA)-GC/MS 的方法，測定煙草中糖苷類潛香物質(zhì)，并對(duì)糖苷類香氣成分進(jìn)行分析，為進(jìn)一步明確煙草中糖苷類潛香物質(zhì)成分、提高煙草香味品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器

甲醇、正戊烷、二氯甲烷、吡啶溶劑購自Sigma-Aldrich，均為色譜純；硫酸銨、碳酸鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉等購自國藥集團(tuán)，均為分析純；衍生化試劑三氟乙酰胺(MBTFA)購自Pierce (Rockford, IL)；糖苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自Sigma-Aldrich。

主要儀器：5973N型氣相色譜質(zhì)譜儀(Agilent)；HP-20 SPE固相萃取小柱(北京綠百草科技發(fā)展有限公司)；Milli-Q系統(tǒng)(Millipore, Bedford)；超聲波發(fā)生儀(BRANSON)；微波反應(yīng)器(Sairem)。

1.1.2 煙葉原料

2018年，采集云南玉溪烤煙K326的C3F、湖北恩施白肋煙Kenek中部葉、云南保山香料煙Basma中部葉樣品，烘干后粉碎過孔徑0.25 mm篩，低溫密封儲(chǔ)存。

1.2 煙葉糖苷測定方法的建立

1.2.1 微波輔助雙水相提取

準(zhǔn)確稱取0.5 g煙葉粉末，加入10 mL甲醇中，超聲溶解30 min，離心，取上清，加入由甲醇與K2HPO4(質(zhì)量比為20∶11)組成的雙水相體系，微波反應(yīng)器中火作用2 min后，靜置冷卻，取上相，過0.45 μm膜，制得糖苷粗提物。

1.2.2 固相萃取

將5 mL糖苷粗提物加到HP-20 SPE小柱上，以0.5 mL/min流速緩慢通過小柱，依次用20 mL超純水、15 mL正戊烷-二氯甲烷洗脫，洗脫速度1.0 mL/min，最后用20 mL甲醇洗脫，洗脫速度為2.0 mL/min，收集甲醇洗脫液，濃縮至干，得糖苷精提物。

1.2.3 衍生化試劑的選擇及其反應(yīng)條件的優(yōu)化

選擇MBTFA作為衍生化試劑，比較不同反應(yīng)溫度(40、50、60、70 ℃)、不同反應(yīng)時(shí)間(30、40、50、60、70 min)、不同試劑用量(100、200、300、400 μL)對(duì)衍生化結(jié)果的影響。

1.2.4 GC/MS 分析

用5973N型氣相色譜質(zhì)譜儀，對(duì)衍生化的物質(zhì)進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析測定。色譜柱為DB-5 MS柱(長30 m、孔徑0.25 mm、膜厚0.25 μm)。程序升溫：起始溫度120 ℃，保持1 min，以3 /min℃ 升至220 ℃，再以5 /min℃ 升至280 ℃，保持10 min。進(jìn)樣量1.0 μL，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度240 ℃。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，離子化方式EI，電子能量70 eV，全掃描，質(zhì)量范圍40～600 amu。苷元采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及NIST譜庫比照定性，定量采用與內(nèi)標(biāo)2-硝基苯-β-D-葡萄糖苷的衍生化產(chǎn)物面積比來計(jì)算(假定響應(yīng)系數(shù)相等)。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化反應(yīng)優(yōu)化條件

MBTFA衍生化條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見圖1。反應(yīng)溫度從40 ℃提高到60 ℃，衍生化產(chǎn)物的峰面積隨著溫度的升高而增加，溫度繼續(xù)升高到70 ℃時(shí)，峰面積反而有所減小。反應(yīng)時(shí)間30～60 min時(shí)，衍生化產(chǎn)物的峰面積隨著時(shí)間的延長而增加，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，峰面積無變化。MBTFA的用量從100 μL增加到400 μL，結(jié)果最低用量即能達(dá)到良好的衍生化效果，增加衍生化試劑用量對(duì)于衍生化效率無明顯影響，反而會(huì)增加GC/MS分析的基質(zhì)背景，影響目標(biāo)物的定性定量。

圖1 不同溫度、時(shí)間、試劑用量下衍生化產(chǎn)物的峰面積 Fig.1 Peak area of derivatives under different temperatures, reaction times, and MBTFA amounts

綜上，選擇衍生化反應(yīng)條件為：100 μL MBTFA試劑，在溫度60 ℃水浴條件下，衍生化反應(yīng)60 min，即可完成衍生化。

圖2為糖苷精提物經(jīng)三氟乙酰衍生化后的GC/MS圖譜。從圖中可以看出，各目標(biāo)物分離良好，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)譜圖(NIST)對(duì)比，共定性鑒定出煙草中18種糖苷鍵合態(tài)香味成分，包括14種葡萄糖苷(β-D-吡喃葡萄糖苷)、1種蕓香糖苷(α-L-吡喃鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)和3種巢菜糖苷(α-L-吡喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)。EI質(zhì)譜分析結(jié)果見表1，可明確其苷元類型為脂肪醇、芳香族化合物、降異戊二烯類、倍半萜類和多酚類化合物。

圖2 煙葉糖苷衍生化產(chǎn)物的氣相色譜質(zhì)譜圖譜 Fig.2 Typical GC/MS separation of TFA glycosidic extracts from tobacco

TFA衍生化產(chǎn)物的EI質(zhì)譜數(shù)據(jù)分為糖元和苷元2個(gè)部分進(jìn)行解析，其中苷元部分離子豐度普遍比糖元部分強(qiáng)，并且這兩部分的碎片離子之間沒有交叉和干擾，這也使糖苷結(jié)構(gòu)的定性更加簡單。

表1 煙草中糖苷類潛香物的定性分析 Table 1 Glycosides qualitative identification for TFA derivatives from flue-cured tobacco

2.2 雙水相–SPE–TFA–GC/MS 法測定煙葉糖苷類潛香物成分

運(yùn)用建立的方法對(duì)烤煙、白肋煙、香料煙樣品進(jìn)行測試分析，GC/MS譜圖結(jié)果見圖3。可以看出，3種煙葉樣品都檢測到18種糖苷類潛香物成分，且分離良好；定量結(jié)果表明，各組分RSD均小于10%，重現(xiàn)性較好。

圖3 煙葉樣品糖苷衍生化產(chǎn)物的氣相色譜質(zhì)譜圖譜 Fig.3 GC/MS separation of TFA glycosidic extracts from different types of tobaccos

煙葉糖苷的定量測定結(jié)果見表2?？緹熀桶桌邿熤刑擒疹惓煞趾枯^香料煙的高，烤煙煙葉中含量較高的糖苷有4-羥基苯乙醇-3-O-葡萄糖苷、3β-羥基-螺巖蘭草酮-3-O-葡萄糖苷和東莨菪苷等，白肋煙煙葉中含量較高的糖苷有3-甲基-丁醇-3-O-葡萄糖苷、苯甲醇-3-O-葡萄糖苷和苯乙醇-3-O-葡萄糖苷等。主成分分析結(jié)果表明，烤煙總糖苷含量與P4 號(hào)、P12 號(hào)、P15 號(hào)、P14 號(hào)4 種糖苷顯著相關(guān)，白肋煙總糖苷含量與P6 號(hào)、P7 號(hào)、P9 號(hào)、P10 號(hào)、P17 號(hào)5 種糖苷顯著相關(guān)，而香料煙總糖苷含量與18 種糖苷沒有顯著相關(guān)性，表明通過糖苷成分分析可以有效區(qū)分3 種不同類型的煙葉。

表2 不同類型煙草的糖苷的相對(duì)含量 Table 2 Relative concentrations of glycoside compounds in three types of tobaccos

3 結(jié)論

建立的雙水相提取-固相萃取SPE-三氟乙酰衍生化TFA-GC/MS方法，能檢測出煙草中18種糖苷類潛香物質(zhì)，包括14種葡萄糖苷(β-D-吡喃葡萄糖苷)、1種蕓香糖苷(α-L-吡喃鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)和3種巢菜糖苷(α-L-吡喃阿拉伯糖-β-D-吡喃葡萄糖苷)，并明確了苷元類型包括脂肪醇、芳香族化合物、降異戊二烯類、倍半萜類以及多酚類化合物。

運(yùn)用該方法對(duì)烤煙K326、白肋煙Kenek、香料煙Basma煙葉中18種糖苷類潛香物組分進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明，烤煙中多酚類以及倍半萜系類糖苷含量明顯高于其他煙葉，白肋煙中含量較高的糖苷則為降異戊二烯類糖苷，而香料煙中芳香族苷元所占比例最大，烤煙中糖苷類潛香物含量最高，香料煙中含量最低。