瘤胃源酵母的分離篩選及其在不同精粗比飼糧中對瘤胃體外發(fā)酵的影響

高曉莎 ，段晉偉，張艷冰，韓郭皓，鈔瑞敏，裴彩霞，武晉孝，古少鵬*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省飼料獸藥監(jiān)察所，山西太原 030027）

為提高反芻動物的生產(chǎn)效率，飼養(yǎng)過程中大量使用高精料日糧，導(dǎo)致反芻動物瘤胃pH 降低，微生物功能紊亂，以瘤胃酸中毒為主的代謝性疾病發(fā)病率增高，造成養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大[1]。在日糧中添加益生菌可使瘤胃pH 升高，恢復(fù)瘤胃微生物功能，可防止瘤胃酸中毒的發(fā)生和維持瘤胃微生物平衡[2]。在高精料條件下，活性酵母可以通過提高瘤胃內(nèi)pH，降低瘤胃乳酸含量，提高微生物利用氨態(tài)氮（NH3-N）的效率和合成微生物菌體蛋白（MCP）的能力，提高瘤胃揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量來改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，從而提高對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[3]。目前養(yǎng)殖生產(chǎn)中所用的酵母產(chǎn)品菌株主要來自外界環(huán)境，而這種消化道外的酵母菌的生存環(huán)境與瘤胃環(huán)境并不一致，這可能影響酵母菌在動物消化道內(nèi)的作用效果，導(dǎo)致當(dāng)前所用的酵母產(chǎn)品在反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用效果不穩(wěn)定，因此，利用源自于動物消化道內(nèi)的微生物可能避免酵母菌在反芻動物生產(chǎn)中應(yīng)用效果不穩(wěn)定的問題[4]。

本試驗旨在分離篩選瘤胃源性酵母，通過體外發(fā)酵技術(shù)，研究在不同精粗比飼糧中添加酵母菌對反芻動物瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，為研制防治亞急性瘤胃酸中毒（SARA）的微生態(tài)制劑提供菌株。

1 材料與方法

1.1 模擬瘤胃體外發(fā)酵裝置 采用100 mL（具有5 mL分刻度）的具塞玻璃注射器（LABORTECHNK D-89173 Lonsee-Efflenschieβ，德國）作為人工瘤胃體外產(chǎn)氣管。

1.2 瘤胃液的采集及酵母菌的分離純化 于晨飼前分別從4 頭裝有永久性瘺管的荷斯坦雄牛和4 只裝有永久性瘺管的杜泊羊×小尾寒羊雜交羊（牛、羊飼喂日糧組成及營養(yǎng)成分見表1、表2）的瘤胃抽取瘤胃液，4 層紗布過濾，置于充有CO2的保溫瓶。取1 mL 過濾后的瘤胃液，以10、100、1 000 倍的梯度稀釋，將稀釋后的瘤胃液涂布于制備好的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基[5]，置于39℃的恒溫培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)過程中觀察菌落生長情況，挑取形態(tài)、顏色等不同單菌落進(jìn)行盧哥氏染色鏡檢，并通過平板劃線的方法對其進(jìn)行反復(fù)純化，至所有菌株形態(tài)完全一致后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酵母菌的篩選

1.3.1 乳酸利用率的測定 將分離純化的酵母菌置于含一定濃度的乳酸液體培養(yǎng)基[4]，39℃，180 r/min 恒溫振蕩器培養(yǎng)24 h，使用分光光度計，在波長為560 nm 下，通過對羥基聯(lián)苯比色法測定培養(yǎng)基中乳酸含量，計算酵母菌對乳酸的利用率。

1.3.2 生長曲線的測定 將乳酸利用率較高的菌株置于麥芽汁肉湯培養(yǎng)基，39℃，180 r/min 培養(yǎng)，從0 h 開始至24 h 結(jié)束，每2 h 取樣1 次，4℃保存。同時做空白對照，使用分光光度計在波長為600 nm 下測定OD值，繪制生長曲線。

1.4 酵母菌的鑒定 將篩選出的乳酸利用率較高、生長速率較快的菌株于麥芽汁肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，收集菌液。將收集到的菌液送至上海凌恩生物科技有限公司通過18S rRNA 測序。引物序列：上游引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'），下游引物NS4（5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 10 mmol/L 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，Taq 酶0.5 μL，去 離 子 水35.5 μL。反 應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72℃修復(fù)延伸10 min，4℃保存。測序結(jié)果通過BLAST 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，再使用MEGA（7.0）軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 牛日糧組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 羊日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)） %

1.5 酵母菌對不同精粗比飼糧瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

1.5.1 人工唾液的配制 參照 Menke 等[6]注射器式培養(yǎng)方法進(jìn)行瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)。人工唾液參照布同良[7]所述方法進(jìn)行配制。

1.5.2 試驗設(shè)計與瘤胃液接種 將篩選的酵母菌用麥芽汁肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，采用血球板計數(shù)法計數(shù)，使菌液的含菌量為3×108CFU/mL。

試驗日糧以玉米為主要精料原料，以玉米秸稈、苜蓿干草、青貯飼料為主要粗料原料，配制日糧精粗比分別為5:5（日糧A）、6:4（日糧B）和7:3（日糧C）的日糧，3 種日糧組成成分及營養(yǎng)成分見表3。每種日糧設(shè)置3、6、9、12、20、28、36、48 h 8 個采樣時間點，每個采樣時間點設(shè)置3 個重復(fù)。測定各個時間點的產(chǎn)氣量、pH、NH3-N 濃度、VFA 濃度、MCP 濃度及干物質(zhì)降解率。

表3 日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)） %

于晨飼前采集雜交肉羊瘤胃液，經(jīng)4 層紗布過濾后，裝入充有CO2的保溫瓶，迅速將瘤胃液與緩沖液（人工唾液）按1:2 的比例制備培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液70 mL 加入7 mL 酵母菌液的比例制備發(fā)酵液，取30 mL 發(fā)酵液加入已裝有不同精粗比日糧的發(fā)酵管（整個過程中需要通入CO2以保持發(fā)酵管的厭氧環(huán)境），迅速放入39℃的恒溫水浴搖床培養(yǎng)。

1.5.3 樣品的采集與處理 待各時間點培養(yǎng)結(jié)束后，采集樣品，立即記錄各發(fā)酵管中的總產(chǎn)氣量，測定各發(fā)酵管培養(yǎng)液pH，將培養(yǎng)液置于-20℃冰箱保存，隨后取樣測定NH3-N、VFA、MCP 濃度；同時將發(fā)酵殘留物用蒸餾水沖洗后放入65℃烘箱烘干，測其降解率。

1.6 測定指標(biāo)及方法 培養(yǎng)液中pH 用酸度計測定；產(chǎn)氣量根據(jù)注射器活塞頂起的刻度直接讀數(shù)[8]；NH3-N 濃度采用馮宗慈等[9]比色法紫外分光光度計測定；VFA濃度采用毛細(xì)管氣相色譜（安捷倫GC-6890N，美國）測定[10]；MCP 濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定；干物質(zhì)降解率根據(jù)發(fā)酵后殘留物烘干后的重量計算，計算公式：干物質(zhì)降解率=（底物干物質(zhì)重量－發(fā)酵后殘渣干物質(zhì)重量）／底物干物質(zhì)重量×100% 。

1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行初步整理，SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素ANOVE 分析，并用Duncan′s 法和LSD 法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用Sigmaplot （10.0）對時間與各指標(biāo)進(jìn)行一元線性和一元二次曲線回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃源酵母的分離純化 瘤胃液經(jīng)平板涂布、劃線分離，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上大量挑取菌落呈乳白色或紅色，大小1～2 mm，棋子狀突起，邊緣整齊，表面濕潤的單菌落，反復(fù)純化培養(yǎng)；在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，管壁有菌環(huán)，管底有沉淀，液體澄清。顯微鏡下觀察，呈橢圓狀，多為單個或成對出現(xiàn)。最終從奶牛瘤胃中分離得到32 株疑似酵母菌菌株，從雜交肉羊瘤胃中分離得到15 株疑似酵母菌，共47 株。

2.2 瘤胃源酵母的篩選 獲得12 株乳酸利用率較高的疑似菌株，其中8 株生長速率較快（圖1、圖2）。選取1 株乳酸利用率較高且生長速率較快的疑似酵母菌菌株，編號為N09 號。

2.3 瘤胃源酵母菌的鑒定 將測序所得的序列采用BLAST 軟件，與GenBank 中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N09 號分離株與Candida rugosa種相似性達(dá)到99.78%（圖3），故將該菌歸屬于Candida rugosa種，即褶皺假絲酵母菌，命名N09 號酵母菌。

2.4 N09 號酵母菌對不同精粗比飼糧瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

2.4.1 N09 號酵母菌對瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響 由圖4 可知，3 組日糧精粗比的發(fā)酵時間與產(chǎn)氣量均存在線性關(guān)系，隨著時間的延長，各組產(chǎn)氣量增加；產(chǎn)氣量隨著日糧精粗比的提高有降低趨勢；在各時間點，3 組培養(yǎng)液的產(chǎn)氣量基本為6:4 組高于5:5 組和7:3 組。

2.4.2 N09 號酵母菌對瘤胃體外發(fā)酵干物質(zhì)降解率的影響 由圖5 可知，3 組日糧精粗比的干物質(zhì)降解率與時間存在線性關(guān)系，各組隨著培養(yǎng)時間的延長，干物質(zhì)降解率增加；同一時間，隨飼糧精粗比的增加，干物質(zhì)降解率呈增加趨勢；除9、36 h 時，5:5 組與6:4 組無顯著性差異外，其余各時間點6:4 組和7:3 組的干物質(zhì)降解率均顯著高于5:5 組，且在各時間點，3 組干物質(zhì)降解率為7:3 組高于6:4 組和5:5 組。

2.4.3 N09 號酵母菌對瘤胃體外發(fā)酵pH 的影響 由圖6可知，3 組日糧精粗比的時間與pH 之間均存在線性關(guān)系，隨著培養(yǎng)時間的延長，pH 逐漸降低；pH 隨日糧精粗比的升高有降低的趨勢。除在20、48 h 時，其余各時間點，6:4、7:3 組培養(yǎng)液pH 顯著高于5:5 組。

2.4.4 N09 號酵母菌對瘤胃體外發(fā)酵NH3-N 濃度的影響由圖7 可知，3 組日糧精粗比的時間與NH3-N 濃度之間均存在線性關(guān)系，各組隨培養(yǎng)時間的延長，NH3-N 濃度升高；隨飼糧精粗比的升高，3 組培養(yǎng)液NH3-N 濃度呈降低的趨勢（P＞0.05）。

2.4.5 N09 號酵母菌對瘤胃體外發(fā)酵MCP 濃度的影響由圖8 可知，3 組日糧精粗比的時間與MCP 濃度之間均存在一元二次曲線關(guān)系，各組培養(yǎng)液中MCP 濃度隨時間的延長先升高后降低；隨飼糧精粗比升高，MCP濃度呈升高趨勢，除12 h 外，其他時間點，3 組培養(yǎng)液MCP 濃度差異不顯著。

2.4.6 N09 號酵母菌對瘤胃體外發(fā)酵VFA 濃度的影響3 組日糧精粗比的時間與VFA 濃度之間均存在線性關(guān)系，3～36 h，各組培養(yǎng)液中總VFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度隨時間延長呈上升趨勢，乙酸/丙酸呈下降趨勢?？俈FA、乙酸、丙酸和丁酸濃度在9、20 h 時5:5 組和7:3組顯著高于6:4 組，12、36 h 時，5:5 組和7:3 組高于6:4組；在28 h 時，總VFA、乙酸濃度5:5 組顯著高于6:4組和7:3 組，丙酸和丁酸濃度差異均不顯著；48 h 時，總VFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度5:5 組和6:4 組顯著高于7:3 組；乙酸/ 丙酸除在20 h 時6:4 組顯著高于5:5組和7:3 組，其余各時間點差異均不顯著（圖9）。

3 討 論

研究表明，活性干酵母或酵母培養(yǎng)物能夠改善瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)，抑制乳酸產(chǎn)生菌并刺激乳酸利用菌的生長，降低高精料日糧條件下瘤胃乳酸含量，提高瘤胃pH 和瘤胃總VFA、乙酸、丙酸濃度，降低NH3-N 濃度，穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境[3-11]。本研究從瘤胃中篩選出1 株乳酸利用率較高，生長速率較快的菌株，該菌對乳酸的利用率可達(dá)62.69%，說明其對乳酸具有較強(qiáng)的代謝能力；體外發(fā)酵試驗表明，在高精料日糧條件下，添加該菌提高了瘤胃內(nèi)pH 和總VFA、乙酸、丙酸濃度，降低了NH3-N 濃度，說明酵母菌可以提高反芻動物瘤胃內(nèi)pH，預(yù)防SARA 的發(fā)生。

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是評定反芻動物瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)，在一定程度上可以反映干物質(zhì)降解率的程度[12]。有研究表明，添加益生菌可以通過消耗瘤胃內(nèi)氧氣使發(fā)酵液環(huán)境處于厭氧狀態(tài)，分泌有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)，在一定程度上促進(jìn)纖維素的分解[13]。本試驗中，添加酵母菌后發(fā)酵液的產(chǎn)氣量和干物質(zhì)的降解率與娜仁花等[8]試驗相比均有提高，且隨著培養(yǎng)時間的延長，產(chǎn)氣量和干物質(zhì)的降解率呈增加趨勢，說明添加酵母菌刺激了瘤胃微生物的生長，這與丁洪濤等[14]的研究結(jié)果一致。

pH 是反映瘤胃發(fā)酵狀況的一個綜合指標(biāo)，而飼糧精粗比是影響瘤胃pH 的一個重要因素，通常認(rèn)為正常瘤胃的pH 變化范圍為6.0～7.0[15]。研究顯示[16]，精粗比在7:3 時，可導(dǎo)致SARA 的發(fā)生。本試驗結(jié)果顯示，隨飼糧精料比例的增加，瘤胃pH 有升高的趨勢，pH變化范圍在6.10～6.61，高于周為琴等[17]在日糧精粗比為6:4 時的pH，說明添加酵母菌對瘤胃pH 有調(diào)節(jié)作用，可以刺激瘤胃內(nèi)乳酸利用菌的生長，提升瘤胃pH，防止在高精日糧條件下瘤胃pH 降低。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為pH＜5.6 時，反芻動物發(fā)生SARA。本試驗各組的pH 均在正常范圍，說明添加酵母菌在高精日糧下可維持瘤胃pH 正常，預(yù)防SARA 的發(fā)生。

瘤胃NH3-N 是飼料蛋白在瘤胃中的降解產(chǎn)物，是菌體蛋白合成的原料；因此，NH3-N 濃度在一定程度上能反映蛋白質(zhì)降解與合成間的一個平衡狀態(tài)。本試驗中，在不同精粗比飼糧條件下，隨發(fā)酵時間的延長，NH3-N濃度升高，隨精料比例的增加，添加酵母菌，各組發(fā)酵液間NH3-N 濃度和MCP 濃度變化不大，但與陳曉霞等[18]的試驗在精粗比5:5 時結(jié)果相比，瘤胃NH3-N 濃度降低，說明添加酵母菌可以使瘤胃內(nèi)NH3-N 更多的轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，從而使瘤胃內(nèi)NH3-N 濃度降低，MCP 濃度升高。

VFA 是瘤胃微生物降解日糧中的碳水化合物的終產(chǎn)物，是維持反芻動物機(jī)體能量的重要來源[19]，乙酸/丙酸值是反映能量利用率的重要指標(biāo)。本試驗中，隨發(fā)酵時間的延長，總VFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度呈上升趨勢，乙酸/ 丙酸呈下降趨勢，隨飼糧精粗比的增加，VFA 無明顯的規(guī)律性。娜仁花等[8]在精粗比為6:4 時的瘤胃體外發(fā)酵試驗中，在2～18 h 時乙酸含量為24.9～33.1 mmol/L，丙酸含量為6.47～9.13 mmol/L。而本試驗添加酵母菌液后，VFA 含量均高于娜仁花等[8]試驗中VFA 含量，表明添加酵母菌能夠增加瘤胃中活菌數(shù)量，加速飼糧中碳水化合物的降解，提高粗飼料的利用率，具有促進(jìn)VFA 產(chǎn)生的作用，這與張翔飛[3]的試驗結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

瘤胃體外發(fā)酵試驗顯示，在飼糧中添加N09 號酵母，可以降低瘤胃液pH，促進(jìn)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的增加，提高干物質(zhì)的降解率，可為生產(chǎn)中預(yù)防高精日糧條件下SARA 的發(fā)生提供參考依據(jù)。