長白豬CIDEC 基因、啟動(dòng)子的克隆及其在不同組織中的表達(dá)研究

李紅強(qiáng)，郭振清，孫 健

(河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北秦皇島 066600）

豬肉是日常生活中最常食用的肉類產(chǎn)品之一，隨著經(jīng)濟(jì)水平和健康意識(shí)的不斷提高，人們對豬肉品質(zhì)的要求越來越高。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪沉積與肉品質(zhì)有關(guān)，脂肪含量影響瘦肉組織的百分比和肉品質(zhì)[1-2]，因此對脂肪沉積尤其是肌內(nèi)脂肪沉積的改良一直是遺傳育種工作的重要目標(biāo)。

豬背最長肌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡DFF45樣效應(yīng)因子C（Cell Death-Inducing DNA Fragmentation Factor alpha-like Effector C，CIDEC）基因在肌內(nèi)脂肪中高表達(dá)[3]；羊蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CIDEC 在寒冷和饑餓狀態(tài)下低表達(dá)，有利于脂滴分解，為機(jī)體提供能量[4]；肉雞高甘油三酯組肌內(nèi)脂肪高通量數(shù)據(jù)顯示，CIDEC是參與調(diào)控代謝的重要基因[5]，也有研究發(fā)現(xiàn)CIDEC參與雞脂肪肝的形成[6]。這些結(jié)果都表明CIDEC 是調(diào)控脂肪沉積的關(guān)鍵因子。

目前多數(shù)研究報(bào)道CIDEC 參與脂滴融合[7]、生長[8]和脂肪肝[9]、動(dòng)脈粥樣硬化[10]等疾病的形成。CIDEC主要在白色脂肪組織中表達(dá)，對于單室大脂滴的形成起著關(guān)鍵作用[11-14]。CIDEC過表達(dá)后細(xì)胞中多個(gè)單室小脂滴聚合形成單室大脂滴[15]；相反，敲除CIDEC后脂滴明顯減小，線粒體和脂滴數(shù)量增加，葡萄糖的吸收和脂肪水解作用增強(qiáng)[16]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，CIDEC定位于脂滴和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，能夠促進(jìn)脂滴的融合，且禁食條件下該基因的表達(dá)上調(diào)十分明顯[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)CIDEC啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括PPARγ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ）[19]、PGC1α（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1 Alpha）[20]、SREBP（Sterol Regulatory Element Binding Proteins）[21]等。

目前研究顯示，CIDEC是豬肌內(nèi)脂肪沉積的重要候選基因，但該基因的具體功能尚未報(bào)道。本研究采用RT-PCR、降落PCR 技術(shù)獲得了長白豬CIDEC基因以及啟動(dòng)子序列且對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，隨后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析了CIDEC基因在長白豬不同組織的分布情況，為深層次揭示長白豬CIDEC 的功能以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取體重約100 kg 的8 頭6 月齡去勢長白豬（河北昌黎縣肉聯(lián)廠提供）為供試材料，采集豬心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、皮下脂肪、腿肌、頸闊肌、肱二頭肌、小腸和空腸12 種組織，立即置于液氮速凍，用于提取RNA 或DNA。

1.2 長白豬總RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄與DNA 提取 用TRIzol（Ambion，美國）提取長白豬各組織總RNA，RNA完整性用瓊脂糖凝膠電泳（1%）進(jìn)行檢測，濃度和純度用NanoDrop2000（Thermo，美國）檢測，檢測合格后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Abcam，中國）合成cDNA?？焖貲NA 提取檢測試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）提取長白豬肝臟基因組DNA，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 長白豬CIDEC基因的克隆 根據(jù)GenBank 中豬CIDEC基因序列（登錄號(hào):NM_001112689.1），通過Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。提取長白豬肝臟組織RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板利用不含酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL，模 板（100 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1 μL，加入ddH2O 9.5 μL補(bǔ)足25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：96℃ 5 min；96℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T（寶生物工程有限公司，中國）相連接，以帶酶切位點(diǎn)的引物再次擴(kuò)增后將PCR 產(chǎn)物回收，利用限制性內(nèi)切酶酶切并與pcDNA-3.1 載體相連、轉(zhuǎn)化，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 通過qRT-PCR 檢測CIDEC在各組織中的表達(dá) 利用Primer5.0 設(shè)計(jì)定量PCR 引物（表1），由北京輝遠(yuǎn)科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR PCR mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）10 μL，cDNA（100 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性，95℃ 5 min；循環(huán)反應(yīng)，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；融解曲線，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參校正個(gè)體間差異，以2-△△Ct方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism5 分析CIDEC在長白豬不同組織間的表達(dá)差異。

1.5 降落PCR 擴(kuò)增CIDEC啟動(dòng)子 從Ensembl 數(shù)據(jù)庫篩選豬CIDEC啟動(dòng)子序列，選取基因5'端上游約2 000 bp和第一個(gè)外顯子下游200 bp 作為預(yù)測的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列并用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物（表1）。采用降落PCR 擴(kuò)增長白豬CIDEC啟動(dòng)子，在冰上建立10 μL PCR 體系：10×Pfu DNA pol Buffer 1 μL，模 板（100 ng/μL）1 μL，Pfu DNA 聚合酶0.3 μL，上下游引物（10 pmol/L）各0.25 μL，dNTP（各2.5 mM/L）1 μL，ddH2O 6.2 μL。降落PCR 程序設(shè)置為95℃ 5 min；95℃ 45 s；65/50℃45 s，72℃ 3 min，95℃ 45 s，15 個(gè)循環(huán)；50/55℃ 45 s，72 ℃ 3 min，72 ℃ 5 min，30 個(gè) 循 環(huán)；4 ℃保 存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用D2500 Gel Extraction Kit（Omega）對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化DNA 產(chǎn)物與pGL-3 Basic 載體連接，建立10 μL 連接體系：回收目的片段6 μL，300 ng/μL pGL-3 Basic 載體2 μL，T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α，挑取單克隆菌落并進(jìn)行測序。

表1 長白豬CIDEC 基因CDS、啟動(dòng)子克隆和熒光定量PCR 引物

1.6 長白豬CIDEC生物信息學(xué)分析 利用NCBI 中BLAST 在線對比工具檢索豬CIDEC基因的核苷酸序列，通過expasy 網(wǎng)站的protparam 工具、TMpred 工具以及TMHMM 工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TM HMM/）預(yù)測CIDEC 蛋白的理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域，使用SPOMA 工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/）和Swiss model 預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，NetPhos 3.1 和NetOGlyc4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/）預(yù)測該蛋白的磷酸化位點(diǎn)和甲基化位點(diǎn)。使用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行生物進(jìn)化樹的構(gòu)建。使用Methprimer 工具預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)域CpG 島（http://www.urogene.org/cgi-bin/meth primer/methprimer.cgi）。

2 結(jié)果

2.1 長白豬CIDEC基因的克隆 以長白豬皮下脂肪組織cDNA為模板，通過RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增長白豬CIDEC基因的CDS 序列，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 條帶（圖1-A），該條帶與Marker 相比在750 bp 附近位置，與預(yù)期設(shè)計(jì)條帶大小一致。提取質(zhì)粒并利用PCR技術(shù)以質(zhì)粒為模板驗(yàn)證條帶情況（圖1-B），結(jié)果顯示CIDEC條帶在750 bp 左右，與預(yù)期條帶大小相符，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序獲得核苷酸序列與NCBI 公布的序列一致。

2.2 長白豬CIDEC 生物信息學(xué)分析

2.2.1 長白豬與其他物種系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫下載牛（Bos taurus，登錄號(hào)：NP_001069499.1）、綿羊（Ovis aries，登錄號(hào)：NP_001293044.1）、豬（Sus scrofa，登錄號(hào)：NP_001106159.2）、人（Homo sapiens，登錄號(hào)：NP_001308071.1）、駱駝（Camelus dromedarius，登錄號(hào)：XP_010983254.1）、馬（Equus caballus，登錄號(hào)：XP_023475767.1）、小鼠（Mus musculus，登錄號(hào)：NP_001359193.1）、大鼠（Rattus norvegicus，登錄號(hào)：NP_001019504.2）、梭鱸（Sander lucioperca，登錄號(hào)：XP_031134281.1）幾個(gè)物種的氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，圖2 顯示，豬與羊、牛的親緣關(guān)系最近，其次為靈長類。

2.2.2 長白豬CIDEC 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測 CIDEC 蛋白共有248 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為27.899 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為8.95，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（天冬氨酸和谷氨酸）為25，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（精氨酸和賴氨酸）為31，其分子式為C1242H1997N333O364S15，原子總數(shù)為3 951。長白豬CIDEC 蛋白的氨基酸殘基中，頻率最高的是亮氨酸（占13.71%），頻率最低的是色氨酸（占0.81%），不含有吡咯賴氨酸及硒半胱氨酸。

2.2.3 長白豬CIDEC 的跨膜區(qū)和疏水性預(yù)測 預(yù)測長白豬CIDEC 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)（圖3-A），根據(jù)預(yù)測說明分值超過500 表示具有一個(gè)跨膜區(qū)，即圖中圈注位置。該跨膜區(qū)位于200～214 位氨基酸（TMHs），其中第1～199位氨基酸位于細(xì)胞膜外，而第215～248 位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)。進(jìn)一步預(yù)測長白豬CIDEC 的疏水性（圖3-B），在32～40 位氨基酸有一段疏水區(qū)，67～96 位氨基酸有一段較長區(qū)域的疏水區(qū)，197～216 位氨基酸有一段疏水區(qū)。

2.2.4 長白豬CIDEC 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 分析長白豬CIDEC 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占47.18%、12.9%、5.65%、34.27%，說明α-螺旋和無規(guī)則卷曲為二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式。α-螺旋比較突出的區(qū)域是5～18、33～42、66-91、104～110、165～178、191～207、215～225、242～248，無規(guī)則卷曲比較突出的區(qū)域是1～4、43～54、124～148、226～241。β-轉(zhuǎn)角與延伸鏈分布比較分散，比較集中的區(qū)域不顯著。長白豬CIDEC三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模顯示（圖4-A），全面模型評(píng)估值（Global Medal Quality Estimation，GMQE）是0.28，118 個(gè)殘基（48% 的序列）已經(jīng)通過單一最高評(píng)分，模型建立符合要求。分析與豬CIDEC 相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與CIDEA、PLIN1、PPAR2A、ACADL 等蛋白質(zhì)存在相互作用（圖4-B）。

2.2.4 長白豬CIDEC 磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測 分析長白豬CIDEC 激酶磷酸化修飾位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)，結(jié)果顯示其氨基酸序列中有45 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，磷酸化位點(diǎn)分別位于酪氨酸、蘇氨酸及絲氨酸的殘基之上。根據(jù)“得分高于0.5 分以上位點(diǎn)發(fā)生了磷酸化”的標(biāo)準(zhǔn)，其中有1 個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)、12 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)及32 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)。對該蛋白糖基化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)有12 處，分別位于33、34、35、38、43、46、58、59、130、139、141、232 氨基酸殘基。

2.3 長白豬CIDEC基因在不同組織中的表達(dá)分析 由圖5 可知，CIDEC基因在各個(gè)組織均有表達(dá)，其中在皮下脂肪組織最高，極顯著高于其他組織，其次在肱二頭肌、肺、小腸中高表達(dá)，在心臟、肝臟、脾臟都有不同程度的表達(dá)，在腿肌、頸闊肌、空腸和腎中極顯著低于其他組織。

2.4 長白豬CIDEC啟動(dòng)子的克隆與CpG 島分析 采用降落PCR 技術(shù)擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)域，產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖6）。對照DL2000 檢測重組質(zhì)粒的片段長度，條帶清晰完整，無非特異性條帶，條帶大小在2 000 bp，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果大小一致。分析啟動(dòng)子序列CpG 島分布情況（圖7），結(jié)果顯示該序列不存在典型的CpG 島，說明長白豬的CIDEC啟動(dòng)子區(qū)不依賴于CpG 島調(diào)控區(qū)域，提示該區(qū)域發(fā)生甲基化的幾率很低，轉(zhuǎn)錄活性不受甲基化抑制。

3 討 論

本研究克隆了CIDEC基因的CDS 序列，該序列為747 bp，編碼248 個(gè)氨基酸。CIDEC基因在豬中有2個(gè)剪切體，即CIDECα、CIDECβ，前者比后者在N 端少編碼10 個(gè)氨基酸[22]，該文所獲得序列為CIDECβ，與報(bào)道相符。該基因在羊中編碼238 個(gè)氨基酸[23]，在牛中編碼222 個(gè)氨基酸[24]，在人中編碼238 個(gè)氨基酸[25]，說明該基因在不同物種之間存在差異。通過同源性分析發(fā)現(xiàn)，豬與牛、羊的同源性較高，說明其在物種間進(jìn)化具有較高的保守性。

本文采集了長白豬心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、皮下脂肪、腿肌、頸闊肌、肱二頭肌、小腸、空腸12 個(gè)不同部位的組織樣品，通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)CIDEC在皮下脂肪組織中高表達(dá)，這與在小鼠中的研究結(jié)果一致[26]。另有研究發(fā)現(xiàn)CIDEC在棕色脂肪組織中也有表達(dá)[27]，且其表達(dá)受不同營養(yǎng)情況影響[28]。CIDEC基因在不同組織中的表達(dá)與其功能密不可分，CIDEC敲除小鼠脂肪沉積能力顯著降低[26]，并且表現(xiàn)出代謝綜合癥和胰島素抵抗[29]。本研究中CIDEC在脂肪組織中表達(dá)量最高，而脂肪組織作為能量儲(chǔ)存和動(dòng)員的主要場所參與脂質(zhì)代謝和脂肪沉積，提示不同組織間表達(dá)差異與CIDEC 功能有關(guān)，但目前對豬CIDEC基因在各個(gè)組織的相關(guān)報(bào)道較少，具體的功能仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

多種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控CIDEC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，目前 發(fā) 現(xiàn)C/EBP（CCAAT/Enhancer Binding Protein）、PPARγ、SREBP 直接作用于該基因的啟動(dòng)子區(qū)域[30-31]，而TNF-α可 以 通 過C/EBP 下 調(diào)CIDEC的 表 達(dá)。另外，CIDEC的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本在不同組織中表達(dá)，推測其表達(dá)調(diào)控機(jī)制也不同。研究發(fā)現(xiàn)，CIDECα在白色脂肪組織中高表達(dá)，而CIDECβ在肝臟和棕色脂肪中表達(dá)，CIDECβ表 達(dá) 受 到CREBH (Cyclic-AMP response element-binding protein H) 的 調(diào) 控[32]。豬CIDEC受 哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控目前尚未報(bào)道，對該基因啟動(dòng)子的克隆為其表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究提供幫助。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了長白豬CIDEC真核表達(dá)載體，并對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示CIDEC 在生物進(jìn)化過程中具有高度保守性。通過該基因組織表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)CIDEC在各個(gè)組織均有表達(dá)，其中在皮下脂肪組織表達(dá)量最高，在腿肌、腎臟和空腸中表達(dá)量較低。本研究還成功克隆了長白豬CIDEC基因啟動(dòng)子區(qū)，通過在線軟件Methprimer 預(yù)測發(fā)現(xiàn)不存在CpG 島。