N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的固定化及固定化酶性質(zhì)研究

王惠蘭 吳金勇 陳祥松 袁麗霞 朱薇薇 姚建銘

（1. 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體物理研究所，合肥 230031；2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，合肥 230026；3. 淮南新能源研究中心，淮南 232001）

N-乙 酰 神 經(jīng) 氨 酸（N-acetylneuraminicacid，Neu5Ac）是一種具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，是細(xì)胞膜蛋白的重要組成部分，參與細(xì)胞表面多種生理功能［1］。如提高嬰幼兒智力和記憶力［2］、抗老年癡呆［3］、用作治療病毒感染的藥物［4］、檢測(cè)惡性腫瘤的診斷試劑［5］。鑒于此，研究Neu5Ac的工業(yè)化生產(chǎn)方法顯得十分重要。

Neu5Ac的生產(chǎn)方法主要包括天然抽提法［6］、化學(xué)合成法［7］、微生物發(fā)酵法［8-10］和生物酶法［11-14］等。天然抽提法產(chǎn)率低；化學(xué)合成法反應(yīng)條件苛刻，污染環(huán)境；微生物發(fā)酵法周期長(zhǎng)，不易分離純化；生物酶法反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物較少，屬于環(huán)境友好型方法。而目前Neu5Ac的酶法制備主要是以N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine，GlcNAc）和丙酮酸（Pyruvic acid，Pyr）為底物，先利用N-乙酰葡萄糖胺差向異構(gòu)酶（N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase，AGE） 將 GlcNAc異 構(gòu) 成 N-乙 酰 甘露糖胺（N-acetyl-D-manosamine，ManNAc），再通過N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（N-acetylneuraminic acid aldolase，NAL）催化ManNAc和Pyr生成Neu5Ac。

由上可知，NAL是酶法制備Neu5Ac途徑中的關(guān)鍵酶。相比較于游離酶，固定化酶可以較大程度上彌補(bǔ)穩(wěn)定性差、產(chǎn)物抽提困難和不可重復(fù)利用等缺點(diǎn)［15-18］，更符合工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的要求。酶的固定化方法主要包括物理吸附法、包埋法、直接交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法。其中共價(jià)結(jié)合法主要是通過形成共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合在一起，優(yōu)勢(shì)主要在于操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、易回收。氨基樹脂是一種高度多孔的固定化載體，經(jīng)戊二醛活化后，具有高比面積，載酶量大，酶活高，機(jī)械強(qiáng)度高，使用周期數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)［19-23］。戊二醛作為雙官能團(tuán)交聯(lián)劑在酶的固定化技術(shù)中心有著廣泛的應(yīng)用，它可以將酶和載體與官能團(tuán)共價(jià)連接［16-18］。

雖然已有文獻(xiàn)對(duì)于NAL的固定化進(jìn)行了報(bào)道，但選用的是Eupergit? C等［24-25］國(guó)外進(jìn)口或?qū)嶒?yàn)自制，并不能滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需求。本研究通過對(duì)市面上常見的環(huán)氧樹脂和氨基樹脂進(jìn)行篩選，選擇了國(guó)產(chǎn)商業(yè)化氨基樹脂載體LX-1000HFA對(duì)NAL進(jìn)行固定化工藝研究，優(yōu)化了固定化過程中的反應(yīng)條件，確定了最佳固定化條件，極大地提高了酶的穩(wěn)定性，還對(duì)游離酶與固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較，以期對(duì)工業(yè)化大批量生產(chǎn)Neu5Ac提供數(shù)據(jù)參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用菌株為大腸桿菌BL21（DE3）工程菌，由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏，基因來源于大腸桿菌W3110菌株，并克隆到pET24a載體上。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：ZWY-211B恒溫?fù)u床，上海智誠(chéng)；5 L發(fā)酵罐：上海保興；FE28 pH計(jì)，瑞士梅特勒；JY96超聲破碎儀，寧波新芝；3H16R1高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西；LC-15c液相色譜儀，日本島津；MB-580 多功能酶標(biāo)分析儀，深圳匯松。

試劑：ES-1、ES-103B、ES-108、ESR-1，天津南開和成；LX-1000EA、LX-1000EP、LX-1000HA、LX-1000HFA、LX-1000EP，西安藍(lán)曉；N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰葡萄糖胺，分析標(biāo)準(zhǔn)品；蛋白胨，BR級(jí)，英國(guó)OXOID；酵母浸粉，BR級(jí)，英國(guó)OXOID；瓊脂粉、硫酸卡那霉素，BR級(jí)，上海國(guó)藥；Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京索萊寶；其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化鈉10，必要時(shí)加入瓊脂粉20制備LB固體培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌121℃，30 min。待冷卻至50-60℃，使用前加入卡那霉素使得終濃度為 30 μg/mL。

TB液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉24，蛋白胨12，磷酸二氫鉀2.31，三水磷酸氫二鉀16.43，甘油5.04，高壓蒸汽滅菌121℃，30 min。待冷卻至50-60℃，使用前加入卡那霉素使得終濃度為30 μg/mL。

5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母浸粉8，磷酸氫二鉀4，氯化鈉3，硫酸銨2.5，甘油10，硫酸亞鐵0.3，檸檬酸2.3，硫酸鎂0.49。高壓蒸汽滅菌121℃，30 min。其中硫酸鎂單獨(dú)滅菌。硫酸亞鐵和異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）均于超凈臺(tái)中用無菌注射器和0.22 μm過濾。發(fā)酵過程中加入IPTG，至終濃度為0.1 mmol/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨22.5，酵母浸粉75，甘油300。高壓蒸汽滅菌121℃，30 min。

1.2 方法

1.2.1 酶活的測(cè)定酶活定義：以37℃，pH7.5條件下，1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol N-乙酰神經(jīng)氨酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

酶活測(cè)定：采用高效液相色譜法分別測(cè)定游離酶和固定化酶的酶活［19］。HPLC條件：色譜柱：Aminex HPX-87H；柱溫：60℃；流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4；流動(dòng)相流速：0.60 mL/min；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量10 μL。相對(duì)酶活：在同一批實(shí)驗(yàn)組中，以測(cè)得最高酶活的實(shí)驗(yàn)組數(shù)值為100%，其余實(shí)驗(yàn)組與之的比值（%）為相對(duì)酶活。

式（1）中，T為用于固定化的粗酶液的總酶活，A1為固定化酶的總酶活，A2為抽濾上清的總酶活。

1.2.2 粗酶液的制備 將保藏菌種畫線接種至固體LB平板上活化，37℃培養(yǎng)過夜。然后從平板上挑取一環(huán)菌種，將其接種至LB液體種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)20 h，即為一級(jí)種子液；按1%接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)5 h。

發(fā)酵產(chǎn)酶：全自動(dòng)5L發(fā)酵罐裝液量3L，接種量為5%，起始溫度37℃，補(bǔ)料后降至25℃，起始通氣量1 vvm，進(jìn)氣壓力調(diào)整為0.06 MPa，設(shè)置起始轉(zhuǎn)速為200 r/min，保持溶氧不低于30%，并待pH和溶氧回升時(shí)開始勻速補(bǔ)料，補(bǔ)料速度為4.2 g/L*h。發(fā)酵過程通過25%（M/V）氨水控制pH為7.0，發(fā)酵時(shí)間約為24 h。

發(fā)酵液于4℃，6 000 r/min離心15min，棄去上清得到濕菌體。稱取濕菌體重懸于100 mmo/L磷酸鉀緩沖液（pH8.0）使得菌體終濃度為100 g/L，超聲波破碎（冰水浴，功率400 W，工作時(shí)間3 s，間歇時(shí)間5 s）15 min，4℃下11 000 r/min離心11 min，上清液即為粗酶液。

1.2.3 蛋白濃度的測(cè)定 Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。

1.2.4 樹脂預(yù)處理環(huán)氧樹脂 稱取5 g環(huán)氧樹脂，加入20 mL的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH8.0）混勻，25℃，170 r/min振蕩1 h，蒸餾水洗滌干凈。

氨基樹脂：0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH8.0）配制5%戊二醛溶液。稱取5 g氨基樹脂，加入20 mL配制好的5%戊二醛溶液，在25℃，170 r/min活化1 h，20 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH8.0）洗凈至無戊二醛殘留。

1.2.5 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶固定化方法 稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂載體4 g置于250 mL三角瓶中，加入20 mL 1.0 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）和20 mL NAL粗酶液放置于25℃恒溫?fù)u床中震蕩固定化24 h。真空抽濾，用20 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）洗滌固定化酶顆粒5次，抽干后于4℃保存。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)比較 控制pH相同，在不同的溫度條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的酶活力，并且在不同溫度中處理12 h之后在最適反應(yīng)條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的剩余酶活，考察固定化酶與游離酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性。

控制溫度相同，在不同的pH條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的酶活力，并且在不同pH中處理12h之后在最適反應(yīng)條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的剩余酶活，考察固定化酶與游離酶的最適pH和pH穩(wěn)定性。

將游離酶和固定化酶顆粒密封儲(chǔ)存于4℃冰箱中，每間隔一段時(shí)間取出測(cè)殘余酶活，考察固定化酶與游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

1.2.7 固定化 N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶催化合成N-乙酰神經(jīng)氨酸在50 mL轉(zhuǎn)化體系中，加入0.4 mol/L的N-乙酰葡萄糖胺，1.0 mol/L的丙酮酸鈉，2.5mmol/L的ATP和7.5 mmol/L的氯化鎂。轉(zhuǎn)化10 h和15 h均補(bǔ)料添加2.75 g丙酮酸鈉。在37℃，pH 7.5，轉(zhuǎn)速170 r/min的條件下，加入400 U的NAL固定化酶顆粒，再加入100 U的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶游離酶，反應(yīng)24 h完成后，用20 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）沖洗抽濾，連續(xù)反應(yīng)10次。

2 結(jié)果

2.1 粗酶液蛋白濃度測(cè)定

粗酶液蛋白濃度為20 mg/mL，比酶活為25 U/mg。

2.2 樹脂載體的選擇

分別稱取4 g不同的樹脂載體，進(jìn)行固定化，檢測(cè)不同載體的固定化酶酶活，結(jié)果如表1。由于攜帶官能團(tuán)的不同，不同類型的樹脂對(duì)酶的固定化效果也不同。從表1的結(jié)果可以看出，在9種不同類型的樹脂中，氨基類樹脂LX-1000HFA的固定化效果最好，酶活回收率達(dá)到39.75%。因此，選用LX-1000HFA作為最佳固定化載體進(jìn)行下一步研究。

表1 不同樹脂載體的固定化效果

2.3 樹脂投放量對(duì)固定化的影響

向250 mL的三角瓶中準(zhǔn)確稱取LX-1000HFA載體1 g、2 g、3 g、4 g、5 g、6 g，檢測(cè)不同載量的固定化酶酶活及酶活回收率，結(jié)果如圖1。由圖1中的數(shù)據(jù)可知，固定化酶的相對(duì)酶活隨著載體量的不斷增加在不斷減少，而酶活回收率隨著載體量的不斷增加而增加。載體量為5 g時(shí)酶活回收率達(dá)到45.00%，載體表面的醛基結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)與酶分子結(jié)合達(dá)到了飽和。因此，綜合來看在40 mL的粗酶液中投放5 g載體是最佳的比例。

圖1 樹脂投放量對(duì)固定化的影響

2.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化的影響

往250 mL的三角瓶中準(zhǔn)確稱取篩選的載體5 g，固定不同時(shí)間。檢測(cè)不同固定化時(shí)間的固定化酶酶活，結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，固定化酶酶活隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降最后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)。在2-6 h固定化酶酶活是逐漸升高的，在6 h時(shí)酶活最高，這一階段載體與酶蛋白主要是進(jìn)行簡(jiǎn)單的物理吸附作用，并沒有形成牢固的共價(jià)鍵。固定化時(shí)間在6 h后酶活則逐漸下降，下降到12 h時(shí)固定化酶酶活逐漸穩(wěn)定。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇12 h作為固定化時(shí)間。

圖2 固定化時(shí)間對(duì)固定化的影響

圖3 緩沖液濃度對(duì)固定化的影響

2.5 緩沖液濃度對(duì)固定化的影響

向250 mL的三角瓶中分別加入20 mL的0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L的pH 8.0不同濃度的磷酸鉀緩沖液，并準(zhǔn)確稱取篩選的載體5 g，固定化12 h。檢測(cè)不同緩沖液濃度處理的固定化反應(yīng)下固定化酶酶活，結(jié)果如圖3?？梢钥闯?，隨著緩沖液濃度的不斷增大，固定化酶酶活先增加后降低。當(dāng)緩沖液濃度為1.0 mol/L時(shí)固定化酶酶活最大，而后不斷減少。所以本研究選擇1.0 mol/L為最佳緩沖液濃度。

2.6 緩沖液pH對(duì)固定化的影響

向250 mL三角瓶中分別加入1.0mol/L的pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸鉀緩沖液，并準(zhǔn)確稱取篩選的載體5g，固定化12 h。檢測(cè)不同pH的固定化反應(yīng)下固定化酶酶活，結(jié)果如圖4。偏堿性環(huán)境更適合NAL的固定化，當(dāng)pH為5.5至7.5時(shí)，固定化酶酶活一直隨著pH值的增大而升高。當(dāng)pH為7.5時(shí)，固定化酶活是最高的，所以本研究選擇pH7.5作為固定化的最適pH。

圖4 pH對(duì)固定化的影響

2.7 溫度對(duì)固定化的影響

向250 mL的三角瓶中準(zhǔn)確稱取篩選的載體5 g，加入20 mL的1.0 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 8.0），放置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的恒溫?fù)u床，固定化12 h。檢測(cè)不同溫度的固定化反應(yīng)下固定化酶酶活，結(jié)果如圖5。

由圖5可知，在25℃時(shí)固定化酶活最高，當(dāng)溫度從20℃升高至25℃，固定化酶活是增大的。當(dāng)溫度大于25℃后，固定化酶活則處于一直下降的趨勢(shì)。所以，NAL不適合在高溫下進(jìn)行固定化，本研究選取25℃做固定化的最適溫度。

圖5 溫度對(duì)固定化的影響

2.8 酶學(xué)性質(zhì)的比較

2.8.1 最適反應(yīng)溫度 由圖6可知，游離酶的最適反應(yīng)溫度是35℃，固定化酶的最適反應(yīng)溫度是40℃，NAL被固定化后最適反應(yīng)溫度有所上升。當(dāng)溫度高于40℃，固定化酶和游離酶的酶活都隨著溫度的升高而下降，但固定化酶的下降趨勢(shì)相對(duì)游離酶較平緩。溫度達(dá)55℃時(shí)，游離酶僅剩60%的酶活，而固定化酶仍保持有80%的酶活。這可能是由于游離酶在被固定化后載體分子對(duì)酶分子有一定的保護(hù)作用，從而使得固定化酶的適用溫度范圍較游離酶更廣。

圖6 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度

2.8.2 溫度穩(wěn)定性 由圖7可知，游離酶在35℃時(shí)處理12 h保持有85%左右的酶活，但在70℃中處理12 h只殘余30%的酶活。相比而言，在不同溫度條件下處理12 h，固定化酶的殘余酶活下降速度較低，特別地在35℃時(shí)處理12 h酶活基本無損失，在70℃高溫條件下固定化酶酶活仍保持有71%的酶活。所以，固定化酶的熱穩(wěn)定性顯著優(yōu)于游離酶。

2.8.3 最適反應(yīng)pH 由圖8可以看出，游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)pH均是7.5，說明酶在被固定化后最適反應(yīng)pH并不受影響。當(dāng)pH小于7.5時(shí)，游離酶和固定化酶的相對(duì)酶活都是隨著pH的增大而增大，但游離酶的變化趨勢(shì)較為劇烈。特別在強(qiáng)酸性（pH5.5）條件下游離酶的相對(duì)酶活只有44%左右，而固定化酶還保有70%的酶活。游離酶的構(gòu)象在酸性條件下比固定化酶更容易改變，從而失去活性。因此，固定化酶比游離酶更適應(yīng)強(qiáng)酸性環(huán)境，具有更廣的pH應(yīng)用范圍。

圖7 固定化酶和游離酶的溫度穩(wěn)定性

圖8 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)pH

2.8.4 pH穩(wěn)定性 由圖9可以看出，無論是游離酶還是固定化酶，NAL在強(qiáng)堿性（pH9.0）環(huán)境中酶活相對(duì)于強(qiáng)酸性（pH5.0）穩(wěn)定性更好，這可能與酶本身的性質(zhì)有關(guān)。游離酶經(jīng)固定化后pH穩(wěn)定性有非常大的提升，特別是在酸性環(huán)境中。在pH為5.0的條件下處理12 h，游離酶只剩余10%左右的酶活，而固定化酶還保持在70%的酶活。在pH為7.5的條件下處理12 h固定化酶的酶活基本無損失，而在pH為9.0的堿性環(huán)境中處理12 h，固定化酶的酶活仍然保留有78%?？傮w來說，固定化酶的pH穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。

2.8.5 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 從圖10中可以看出，在4℃條件下儲(chǔ)存2 d后，游離酶只保留有57%的酶活，已經(jīng)接近半衰期了，而固定化酶依然保持在96%的酶活水平。在儲(chǔ)存10 d后，游離酶幾乎喪失全部活性，固定化酶只損失了6%的酶活。固定化NAL酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性較好，且易于儲(chǔ)存。

圖9 固定化酶和游離酶的pH穩(wěn)定性

圖10 固定化酶和游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.8.6 操作穩(wěn)定性 操作穩(wěn)定性是衡量固定化酶效果的一個(gè)重要指標(biāo)之一，它決定著固定化酶在工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值。從圖11中可以看出，轉(zhuǎn)化1次后產(chǎn)生99.3 g/L Neu5Ac，GlcNAc的轉(zhuǎn)化率為80.03%，生產(chǎn)強(qiáng)度為4.14 g/L/h。在連續(xù)轉(zhuǎn)化第3次時(shí)，摩爾轉(zhuǎn)化率為75.18%左右，說明酶的穩(wěn)定性有略微下降的趨勢(shì)。持續(xù)轉(zhuǎn)化10個(gè)批次，最終摩爾轉(zhuǎn)化率能達(dá)到64.67%。故連續(xù)轉(zhuǎn)化10次，酶活能夠保持80%。

固定化酶初次和連續(xù)10次催化合成Neu5Ac的HPLC色譜對(duì)比圖如圖12所示，峰2、3、4、5分別為Neu5Ac、丙酮酸、ManNAc、GlcNAc，其對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間分別為8.6、9.7、11.6、12.2 min。固定化酶在持續(xù)催化第10次后，其摩爾轉(zhuǎn)化率為64.67%，Neu5Ac產(chǎn)量仍達(dá)到80.0 g/L。

3 討論

目前Neu5Ac的酶法制備主要是通過AGE與NAL偶聯(lián)催化實(shí)現(xiàn)的，通常先利用AGE將GlcNAc異構(gòu)成ManNAc，再通過NAL催化ManNAc和Pyr生成Neu5Ac。近些年來，由于固定化酶的可循環(huán)利用性，一些研究者開始將目光投向利用固定化酶生產(chǎn)Neu5Ac。作為酶法生產(chǎn)Neu5Ac的關(guān)鍵酶NAL，其固定化研究早有報(bào)道。2006年楊茂區(qū)等［24］使用Eupergit? C進(jìn)口環(huán)氧樹脂固定化NAL粗酶液，其比酶活僅10.4 U/g。為了提高固定化酶活，2009年胡世元等［25］利用Amberzyme進(jìn)口環(huán)氧樹脂對(duì)NAL純酶進(jìn)行固定化研究，結(jié)果獲得比酶活達(dá)到了69.3 U/g，比之前固定化酶活有較大提高，但酶的純化成本較高，且使用國(guó)外進(jìn)口的樹脂不宜國(guó)內(nèi)進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。2016年Cheng等［19］使用實(shí)驗(yàn)室自制的氨基樹脂對(duì)純化后的NAL進(jìn)行固定化，最終得到固定化比酶活達(dá)183 U/g，但其固定化酶在連續(xù)轉(zhuǎn)化5次后酶活僅初始酶活的75%。

圖11 固定化酶的操作穩(wěn)定性

圖12 固定化酶催化合成Neu5Ac的HPLC色譜圖

本研究使用不同樹脂對(duì)NAL粗酶液進(jìn)行固定化后發(fā)現(xiàn)，采用LX-1000HFA進(jìn)行固定化時(shí)效果最好，可以制備較高酶活的固定化酶。而在固定化過程中，固定化時(shí)間、緩沖液濃度、pH及溫度等因素直接影響了固定化效果。由于LX-1000HFA是一類氨基載體，在2-6 h內(nèi)，酶蛋白僅簡(jiǎn)單地被吸附于載體表面。而隨著固定化時(shí)間延長(zhǎng)至12 h，固定化酶活穩(wěn)定在91%左右時(shí)，這可能是因?yàn)樯倭棵傅鞍字饾u脫落，大量的酶分子與載體之間形成共價(jià)結(jié)合且達(dá)到飽和狀態(tài)［26-27］；適當(dāng)濃度的緩沖液也可能促進(jìn)載體與酶分子的表面疏水作用，促使酶分子被吸附于載體的樹脂表面。當(dāng)緩沖液濃度為1.0 mol/L時(shí)固定化酶活最高，緩沖液濃度為2.0 mol/L時(shí)固定化酶活僅40%左右。這可能是磷酸鹽濃度過高造成酶蛋白變性失活，且易形成較大顆粒，堵塞載體孔徑通道，影響游離酶分子與載體的結(jié)合［28］；當(dāng)體系pH為5.5時(shí)，固定化酶活僅為pH為7.5的41%左右，可能是pH影響了戊二醛的醛基與載體的氨基基團(tuán)反應(yīng)生成的席夫堿的穩(wěn)定性［29］；另外，固定化溫度直接影響了游離酶分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，且低溫時(shí)酶分子熱運(yùn)動(dòng)效率較低，適當(dāng)提高溫度直接影響載體與酶分子的結(jié)合效率［30］，但高溫首先會(huì)直接破壞酶分子的蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶蛋白變性失活。其次氨基載體固定化酶是共價(jià)結(jié)合的方式，高溫會(huì)破壞共價(jià)鍵的形成。所以固定化溫度為25℃時(shí)固定化效果最好，而溫度上升到45℃時(shí)，固定化酶活下降至最高酶活的50%左右。游離酶經(jīng)固定化后，其最佳作用溫度提升5℃，溫度穩(wěn)定性（70℃處理12 h）提高了近2.4倍。最適pH范圍變廣，pH穩(wěn)定性（pH 5.0處理12 h）則提高近7.1倍。值得注意的是，當(dāng)在4℃條件下儲(chǔ)存10 d時(shí)，固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性顯著提高（11.4倍）。

4 結(jié)論

從9種不同類型的載體中，篩選出氨基樹脂LX-1000HFA對(duì)NAL進(jìn)行固定化，經(jīng)優(yōu)化得到最佳固定化條件為：載體投放量5.0 g，固定化時(shí)間12 h，緩沖液濃度1.0 mol/L，pH 7.5，溫度25℃。在此條件下制備得到的固定化NAL，無需純化，酶活達(dá)200 U/g濕載體。通過對(duì)游離酶與固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果相對(duì)于游離酶，固定化酶具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，可適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的復(fù)雜的操作環(huán)境。