響應(yīng)面法優(yōu)化脯氨酸羥化酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)工藝條件

羅素亞 鄭豆豆 何廣正 張琳琳 徐書景 鞠建松

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

反式-4-羥基-L-脯氨酸（L-羥脯氨酸，trans-4-hydroxy-L-proline）是膠原蛋白中特有的一種亞氨基酸，屬于非必需氨基酸，是羥化酶對(duì)L-脯氨酸羥基化修飾的產(chǎn)物，具有增強(qiáng)結(jié)締組織韌性和彈性的功效［1］。膠原蛋白含量最為豐富的材料是骨膠和明膠，骨膠、明膠中L-羥脯氨酸含量為10%-10.5%，脯氨酸含量為12%-13%［2］。人體中L-羥脯氨酸失衡會(huì)引發(fā)諸如老年癡呆、營(yíng)養(yǎng)不良、組織纖維化、軟骨組織和韌帶組織韌性降低等癥狀［3］。目前，針對(duì)L-羥脯氨酸的研究和開發(fā)正受到食品、醫(yī)藥及美容等相關(guān)行業(yè)的廣泛關(guān)注［4-5］。此外，由于反式-4-羥基-L-脯氨酸具有兩個(gè)手性中心，易于衍生化，藥理活性多樣，因此，L-羥脯氨酸可作為醫(yī)藥原料藥的手性中間體，正被廣泛應(yīng)用于合成抗高血壓、抗腫瘤、培南類新型抗生素等多種新型創(chuàng)制類藥物［6］。受這些因素的影響，反式-4-羥基-L-脯氨酸的需求量逐年上升，市場(chǎng)潛力巨大。

我國(guó)目前生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸主要采用化學(xué)水解提取工藝，該工藝以動(dòng)物膠原蛋白為主要原料，通過強(qiáng)酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程制備L-羥脯氨酸，其收率僅為4%-7%［4］，且存在著“三廢”排放量大、原料消耗量大、純度低及能耗高等不足；國(guó)外生產(chǎn)L-羥脯氨酸的主要方法為發(fā)酵法，即生物轉(zhuǎn)化法，該方法以L-脯氨酸和α-酮戊二酸為原料，輔以Fe2+、抗壞血酸鹽，通過脯氨酸羥化酶催化產(chǎn)生L-羥脯氨酸。目前用于生物法轉(zhuǎn)化的脯氨酸羥化酶（L-Proline 4-hydroxylase，P4hy，EC 1.14.11.57）主要來自指孢囊菌（Dactylosporangiumsp.）RH1，該基因（GenBank：D78338.1）的GC含量為73.63%，異源表達(dá)時(shí)主要以包涵體呈現(xiàn)，且催化活性低，影響了該酶的推廣和應(yīng)用［5，7］。

本實(shí)驗(yàn)室在不改變P4hy的氨基酸序列條件下，通過密碼子優(yōu)化將其GC含量降低至61.45%，所構(gòu)建表達(dá)載體pET-P4hy在分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8的協(xié)同下，可溶性蛋白含量明顯提高，催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為72.8%［8］。本實(shí)驗(yàn)以表達(dá)載體pET-P4hy為研究對(duì)象，優(yōu)化蛋白表達(dá)條件和轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，采用響應(yīng)面法預(yù)測(cè)催化反應(yīng)的最適條件，進(jìn)一步提高其催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率、降低生產(chǎn)成本，為生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑 大腸桿菌BL21（DE3）用于蛋白表達(dá)，分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8購自TaKaRa公司，質(zhì)粒pET-P4hy由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［8］，標(biāo)準(zhǔn)品L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸購自Sigma公司，2-（N-嗎啡啉）乙磺酸鈉（MES）、三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES）、哌嗪-N，N-二（2-乙磺酸）（PIPES）和三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）等化學(xué)試劑為分析純。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素和氯霉素均購于Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 重組菌誘導(dǎo)條件優(yōu)化

1.2.1.1 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化 將表達(dá)載體pET-P4hy轉(zhuǎn)化至帶有分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8的大腸桿菌BL21（DE3）中，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單一菌落培養(yǎng)，隨后將種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素（40 μg/mL）和氯霉素（25 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.7時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG（0.1 mmol/L），分別在不同溫度下（16℃、20℃、24℃、28℃和32℃）誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，4℃1 000 r/min離心10 min收集菌體。

將1 g 菌體重懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化反應(yīng)液［200 mmol/L L-脯 氨 酸、200 mmol/L α-酮 戊 二 酸、6 mmol/L 硫酸亞鐵、2 mmol/L L-抗壞血酸、80 mmol/L MES緩沖液（pH 6.5）和1% Nonidet P-40］中，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，28℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣，離心去除菌體，通過HPLC（Wondasil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）檢測(cè)反應(yīng)液中L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率（以標(biāo)準(zhǔn)品的含量和所對(duì)應(yīng)的峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶蛋白催化生成L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化效率），確定其最適誘導(dǎo)溫度。

1.2.1.2 IPTG濃度優(yōu)化 按1.2.1.1所述條件培養(yǎng)重組菌，改變誘導(dǎo)劑濃度（0、0.05、0.1、0.2和0.3 mmol/L），于28℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心收集菌體。以全細(xì)胞為催化劑，參照1.2.1.1所述方法檢測(cè)反應(yīng)液中L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，確定最佳誘導(dǎo)劑濃度。

1.2.2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件優(yōu)化

1.2.2.1 轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度優(yōu)化 在28℃，0.2 mmol/L IPTG下誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌6 h，離心收集菌體。稱取1 g菌體，懸浮在10 mL轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中，置于不同反應(yīng)溫度（20℃、24℃、28℃、32℃和37℃）下恒溫孵育，按照1.2.1所述方法檢測(cè)L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，確定最適轉(zhuǎn)化溫度。

1.2.2.2 反應(yīng)緩沖液及其pH值優(yōu)化 取1.2.1所培養(yǎng)的菌體1 g，分別重懸于80 mmol/L的MES、TES、PIPES和Tris-HCl緩沖劑中，緩沖液pH為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中其他成分與1.2.1一致，于28℃ 140 r/min振蕩反應(yīng)60 h，通過HPLC檢測(cè)上清中L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，確定轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適緩沖液及pH值。

1.2.2.3 緩沖液濃度的篩選 稱取1.2.1所培養(yǎng)的菌體1 g，重新懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中，改變MES和TES緩沖液的濃度（0、20、40、80、120、160、200和240 mmol/L），轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的其余成分與1.2.1相一致，參照1.2.1所述方法檢測(cè)L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，確定緩沖液的最佳濃度。

1.2.2.4 底物配比優(yōu)化 α-酮戊二酸是脯氨酸羥化酶輔底物，其濃度高低可能對(duì)脯氨酸羥化酶的催化活性產(chǎn)生一定的影響［9］。稱取1.2.1所述菌體1 g，懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中（緩沖液濃度參照1.2.2.3中的最佳濃度），其中 L-脯氨酸終濃度固定為200 mmol/L，倍比降低α-酮戊二酸的濃度，使之與L-脯氨酸的濃度之比分別為1/1、1/2、1/4、1/8、1/12和1/16，檢測(cè)反應(yīng)液中L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，篩選α-酮戊二酸的最佳濃度。

1.2.2.5 表面活性劑濃度篩選 表面活性劑具有增加細(xì)胞通透性的功能，有利于底物與酶蛋白接觸，從而提高酶的催化效率［10-11］。前期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分別向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中添加表面活性劑CTAB、SDS、Tween 20、Trixton X-100和Nonidet P-40后，僅Nonidet P-40表現(xiàn)出對(duì)酶蛋白的催化活性有一定影響，而其他4種表面活性劑的影響較小。因此，參照1.2.2.4中的最佳底物配比，調(diào)整轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中表面活性劑Nonidet P-40的濃度，檢測(cè)產(chǎn)物L(fēng)-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，確定Nonidet P-40的最佳濃度。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化P4hy轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件 響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是20世紀(jì)中后葉發(fā)展起來的優(yōu)化試驗(yàn)條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化［12-13］。響應(yīng)面法可同時(shí)對(duì)影響生物產(chǎn)量的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)［14-15］，因此可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件。

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化P4hy轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件（緩沖液pH值，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度和振蕩速度），分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，繪制響應(yīng)面立體分析圖，尋求最佳水平，進(jìn)而確定最佳工藝條件。

2 結(jié)果

2.1 重組菌誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 通過HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，20℃和28℃下誘導(dǎo)所得重組菌的轉(zhuǎn)化率隨轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先快后緩的上升態(tài)勢(shì)（圖1-A），當(dāng)反應(yīng)達(dá)68 h時(shí)，20℃和28℃誘導(dǎo)所得重組菌的轉(zhuǎn)化率接近85%，其他3個(gè)溫度下誘導(dǎo)獲得的重組菌轉(zhuǎn)化率均低于50%；當(dāng)反應(yīng)達(dá)100 h，5個(gè)誘導(dǎo)溫度下重組菌的轉(zhuǎn)化率均可達(dá)100%。由此可見，20℃和28℃是較為理想的誘導(dǎo)溫度，但考慮到28℃接近于室溫，實(shí)驗(yàn)可操作性較好，因此，確定誘導(dǎo)溫度為28℃。

2.1.2 IPTG濃度優(yōu)化 在不同IPTG濃度下誘導(dǎo)所得重組菌的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率如圖1-B所示：產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率均隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，其中未加誘導(dǎo)劑的重組菌轉(zhuǎn)化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率增幅最小，72 h時(shí)其轉(zhuǎn)化率僅為20%；IPTG為0.2 mmol/L時(shí)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率增幅最快，反應(yīng)進(jìn)行至60 h時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率接近100%；而在相同反應(yīng)時(shí)間下，其它濃度下重組菌的轉(zhuǎn)化率均低于65%，說明重組菌誘導(dǎo)所需IPTG的最佳濃度為0.2 mmol/L。

2.2 優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝條件

2.2.1 轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度的優(yōu)化 重組菌在不同轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度下的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化而不斷增長(zhǎng)（圖2-A）。在28℃下，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的增長(zhǎng)更為快速，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)60 h和80 h時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率分別達(dá)97%和100%；而在24℃和32℃下，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行至36 h后，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率也呈急劇上升態(tài)勢(shì)，但最終二者的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率仍然沒有達(dá)到100%。因此，最適反應(yīng)溫度為28℃。

2.2.2 緩沖劑種類及pH值篩選 由圖2-B可見，當(dāng)以Tris-HCl作為緩沖液時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率一直徘徊于30%左右，而其他緩沖體系下產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率則隨著pH值的增加（pH 6.0-6.5）而快速增長(zhǎng)：當(dāng)pH為6.5時(shí)，各緩沖溶液體系下的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最大值（MES，100.0%；TES，95.8%；PIPES，93.1%）；當(dāng)pH值繼續(xù)上升（pH 6.5-8.0），產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中，緩沖體系為MES時(shí)，重組菌的轉(zhuǎn)化率下降較為緩慢；由于MES緩沖體系在pH為6.5-7.0范圍內(nèi)均具有較高的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，因此，MES是較為理想的緩沖劑，其次是TES。

2.2.3 緩沖劑濃度的篩選 由圖2-C和圖2-D可見，當(dāng)緩沖液MES和TES的濃度處于120-240 mmol/L之間時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈快速上升趨勢(shì)；當(dāng)MES和TES濃度為120、240或200mmol/L時(shí)，反應(yīng)60 h后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%；當(dāng)緩沖液濃度介于0-80 mmol/L之間，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的增長(zhǎng)較為緩慢，當(dāng)反應(yīng)60 h時(shí)，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率均低于90%。綜合考慮轉(zhuǎn)化反應(yīng)成本，確定MES和TES緩沖液的最適濃度均為120 mmol/L。

2.2.4 優(yōu)化底物配比 經(jīng)HPLC檢測(cè)，在不同的底物配比下，重組菌的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率均隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（圖2-E）。當(dāng)反應(yīng)延長(zhǎng)至60 h時(shí)，底物α-酮戊二酸與L-脯氨酸濃度之比分別為1/1、1/8和1/12時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率均接近100%；不過，與其他底物配比相比較，底物之比為1/1時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率上升趨勢(shì)更加接近線性上升狀態(tài)，說明底物配比為1/1較為有利于生產(chǎn)L-羥脯氨酸。

2.2.5 Nonidet P-40濃度優(yōu)化 通過檢測(cè)，在含有不同濃度的Nonidet P-40時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈不同程度的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)（圖2-F）。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間介于0-24 h，Nonidet P-40濃度為1.0%時(shí)，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)速度較快；然而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間介于24-48 h，與另外兩個(gè)濃度相比（1%和2%），Nonidet P-40濃度為1.5%時(shí)的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)最快；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為36 h，Nonidet P-40濃度為1.5%時(shí)，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率率先達(dá)到最高值（100%），而其他濃度下則在反應(yīng)進(jìn)行至48 h才達(dá)到最高值。由此可見，Nonidet P-40的濃度采用1.5%為佳。

圖1 重組脯氨酸羥化酶誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面結(jié)果

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用三因素三水平法轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度（A：24℃，28℃和32℃）、緩沖液pH值（B：6.0，6.5和7.0）和振蕩速度（C：100，140和180 r/min）等三因素進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、表2和圖3。表1為不同水平因素下產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面值，根據(jù)表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過design expert 7.1.6軟件處理確定回歸方程為：Y=73.49-11.72A-62.51B+17.73C-3.71AB-5.00AC+5.13BC-25.69A2-37.08B2-23.93C2；表2為該模型的可信度分析結(jié)果：其決定系數(shù)R2= 0.996 7，F(xiàn)值為235.60（P<0.000 1），說明所構(gòu)建模型存在顯著性差異，單因素和雙因素（AB、AC和BC）均對(duì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率有顯著的影響。圖3是三因素對(duì)脯氨酸羥化酶轉(zhuǎn)化率交互影響效應(yīng)分析立體圖，通過嶺嵴分析，轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適pH值為6.6，溫度為27℃，轉(zhuǎn)速為152 r/min。

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值以確定最優(yōu)條件，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次所得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率都達(dá)到了100%，說明響應(yīng)面法獲得的模型與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合度好。

3 討論

L-羥脯氨酸在醫(yī)藥、生化、美容業(yè)等方面有著較為廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求逐年上升，因此，L-羥脯氨酸生產(chǎn)工藝的開發(fā)受到科研工作者的關(guān)注。綜合考慮環(huán)境污染、產(chǎn)品純度和生產(chǎn)成本等因素的影響，采用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-羥脯氨酸無疑是較為理想的方法之一。

圖2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件優(yōu)化

目前國(guó)內(nèi)外主要采用指孢囊菌RH1來源的脯氨酸羥化酶催化L-脯氨酸產(chǎn)生L-羥脯氨酸，由于該基因GC含量過高，該酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到很大影響［5，7］。針對(duì)這個(gè)問題，國(guó)內(nèi)外科研工作者進(jìn)行了廣泛而深入的探究。Klein等［5］通過分子伴侶GroEL/GroES促進(jìn)了酶蛋白P4hy的可溶性表達(dá)，以所構(gòu)建的重組菌為催化劑，催化反應(yīng)72 h后L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率為63%。劉合棟等［16］采用高頻密碼子替換、調(diào)整基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、引入色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子及調(diào)整發(fā)酵補(bǔ)料策略等技術(shù)手段，最終使催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率提高至81.1%。蔡萌萌等［17］通過探究發(fā)酵過程不同階段的溶氧水平對(duì)L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響，提出了分階段溶氧控制策略，最終使L-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)45.3 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到20.7%。Liu等［18］采用增大溶氧量、添加蛋白酶降低發(fā)酵液中可溶性蛋白含量等手段優(yōu)化發(fā)酵工藝，最終發(fā)酵獲得L-羥脯氨酸的含量為45.7 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為18.1%。張琳琳等［8］通過優(yōu)化基因p4hy的密碼子，降低其GC含量，并在分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8的協(xié)同作用下提高了蛋白的可溶性表達(dá)，催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率提高至72.8%。Wang等［19］通過基因挖掘技術(shù)從3株菌中篩選獲得了一個(gè)催化活性最好的脯氨酸羥化酶基因（alp4h），將該基因轉(zhuǎn)入L-脯氨酸生產(chǎn)菌株后，所構(gòu)建的工程菌株產(chǎn)L-羥脯氨酸的產(chǎn)量為3.57 g/L，采用補(bǔ)料發(fā)酵處理36 h后L-羥脯氨酸含量為45.83 g/L；Zhang等［20］通過敲除大腸桿菌中L-脯氨酸代謝相關(guān)基因以及其他影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的基因構(gòu)建工程菌株，經(jīng)過補(bǔ)料發(fā)酵法生產(chǎn)獲得L-羥脯氨酸濃度為31.0 g/L。這些結(jié)果說明了從影響酶蛋白催化反應(yīng)的內(nèi)在因素和外在因素進(jìn)行優(yōu)化或調(diào)控在一定程度上提高脯氨酸羥化酶的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，具有較好的應(yīng)用開發(fā)潛力；不足的是上述研究普遍存在反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)終產(chǎn)物成分復(fù)雜等不利因素。

表1 轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度、pH和振蕩速度三因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度、pH和振蕩速度三因素試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目尚哦确治?/p>

圖3 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率與轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度（A）、pH（B）和振蕩速度（C）的響應(yīng)面圖

為了進(jìn)一步提高酶蛋白P4hy的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本，本實(shí)驗(yàn)以張琳琳等［8］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以影響催化反應(yīng)的外在因素為研究對(duì)象，通過單一因素優(yōu)化法初步篩選獲得了轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最佳條件：蛋白表達(dá)最適誘導(dǎo)溫度為28℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L；轉(zhuǎn)化反應(yīng)最適溫度為28℃，緩沖液為MES（120 mmol/L，pH 6.5-7.0），L-脯氨酸與 α-酮戊二酸濃度均為200 mmol/L（1∶1），表面活性劑Nonidet P-40的濃度為1.5%。隨后，以單因素分析所得的最佳優(yōu)化條件作為Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，對(duì)影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的因素做進(jìn)一步優(yōu)化，通過Design Expert 7.0.3統(tǒng)計(jì)軟件預(yù)測(cè)了影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)三因素的最適條件：轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為27℃，振蕩速率為152 r/min，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液pH值為6.6。驗(yàn)證結(jié)果表明，在預(yù)測(cè)的最佳條件下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行48 h后即可將反應(yīng)底物L(fēng)-脯氨酸全部轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-羥脯氨酸，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá)100%，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物的高效轉(zhuǎn)化。

4 結(jié)論

通過單一因素優(yōu)化法初篩、響應(yīng)面法預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定了最佳蛋白表達(dá)條件和催化反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)了在48 h內(nèi)將反應(yīng)底物L(fēng)-脯氨酸全部轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-羥脯氨酸（100%），確保了產(chǎn)物L(fēng)-羥脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化，同時(shí)也消除了反應(yīng)底物L(fēng)-脯氨酸對(duì)產(chǎn)物分離純化造成的干擾問題，為該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。