氯氰菊酯降解菌草酸青霉SSCL-5分離鑒定及降解特性

陳銳 瞿佳 孫曉宇 鄧媛 門欣 趙玲俠 沈衛(wèi)榮

（1. 陜西省微生物研究所微生物資源研究中心，西安 710032；2. 陜西省科學(xué)院秦嶺天然產(chǎn)物工程中心，西安 710032）

菊酯類農(nóng)藥是目前使用最為廣泛的低毒殺蟲劑，該類農(nóng)藥包括天然除蟲菊素及其衍生物30余種，通過擾亂昆蟲電壓門鈉通道使之麻痹死亡［1］。過去普遍認(rèn)為菊酯類對環(huán)境及人類危害不大，但目前許多研究表明菊酯對藻類、魚類、蜂類等有較高毒性［2-4］，干擾脊椎動物內(nèi)分泌［5］，引起免疫紊亂［6］，影響孕婦及兒童［7］，具有遺傳毒性［8］。為解決土壤中殘留的菊酯類農(nóng)藥的問題，利用微生物進(jìn)行降解是一種經(jīng)濟(jì)且環(huán)保的方法［9］。微生物將農(nóng)藥作為其營養(yǎng)來源可分解礦化有機(jī)分子成為CO2和水，可在短時間內(nèi)有效降低土壤中農(nóng)藥殘留的水平，使土壤恢復(fù)健康狀態(tài)［10］。有研究表明細(xì)菌［11］、真菌［12］均具有效降解菊酯類農(nóng)藥的潛能。本研究從土壤中篩獲得一株真菌菌株，該菌可高效分解利用高濃度氯氰菊酯，可在較寬泛的條件下生存，并且該菌對多種菊酯類農(nóng)藥均有作用，或能解決土壤中殘留菊酯類農(nóng)藥的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本來源于陜西省境內(nèi)棚室、果園及秦嶺等地，共收集土壤樣本70余份。

1.2 方法

1.2.1 氯氰菊酯降解菌的分離 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，（NH4）2SO40.4 g，NaCl 0.5 g，NH4NO31.2 g，K2HPO41.5 g，酵母提取物0.05g，pH 7.0，至1 000 mL。在搖瓶中加入100 mL液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基滅菌冷卻后，加入氯氰菊酯（終濃度1 000 mg/L，大工達(dá) 10%懸浮劑），稱取土樣5 g，28℃ 180 r/min 富集培養(yǎng)7 d，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。將富集菌液梯度稀釋涂布于含氯氰菊酯（1 000 mg/L）的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)7 d。選取菌落進(jìn)行劃線純化，選擇單菌落，KMB或PDA斜面培養(yǎng)，待長出孢子后，取孢子液甘油-80℃低溫保藏。

1.2.2 氯氰菊酯降解菌的篩選 采用紫外分光光度法對篩選出的菌株進(jìn)行氯氰菊酯降解菌的初步篩選。將獲得的菌株活化，于90 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入氯氰菊酯（終濃度1 000 mg/L），接種菌液10mL，28℃ 180 r/min 震蕩培養(yǎng)，24 h后采用紫外分光光度法235 nm測定氯氰菊酯殘留量。取含菌發(fā)酵液4 mL，加入8 mL石油醚，振蕩器上震蕩1 min，靜置10 min，重復(fù)震蕩2次。吸取上層有機(jī)相，235 nm測定氯氰菊酯殘留濃度，標(biāo)準(zhǔn)試劑購自沈陽化工研究院（含量大于99.5%）［13］。選出最優(yōu)菌株后進(jìn)行進(jìn)一步驗證，90 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入氯氰菊酯（終濃度1 000，800，600，500 mg/L），接入菌液10 mL，設(shè)3個重復(fù)，以無菌發(fā)酵液作為平行對照，28℃，180 r/min培養(yǎng)，每12 h、24 h取樣1次，石油醚萃取后，紫外分光光度法235 nm測定氯氰菊酯殘留量。

1.2.3 氯氰菊酯降解菌的形態(tài)鑒定 取菌株在PDA插片平板上接種，28℃培養(yǎng)48 h，待菌絲長至蓋玻片上后鏡檢觀察。分別在MA及CYA平板上接種觀察其菌落形態(tài)。

1.2.4 氯氰菊酯降解菌的生長特性 菌株搖瓶生長曲線：取保藏菌種轉(zhuǎn)接斜面，28℃培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接3次，培養(yǎng)120 h待生成孢子。將孢子重懸至生理鹽水反復(fù)吹吸至均勻，接100 μL孢子懸液入PDA液體搖瓶中，共27瓶，28℃，180 r/min培養(yǎng)，12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h及96 h取發(fā)酵液3瓶。將全部菌體過濾至定量濾紙，烘干稱重。測定菌絲發(fā)酵生長情況。

菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢量測定：以麩皮 50 g，稻殼10 g，水40 mL，豆粕0.1 g，大米粉2 g，植物油500 μL作為固體培養(yǎng)基，取搖瓶培養(yǎng)對數(shù)期菌絲液10%接種固體發(fā)酵，28℃ 240 h培養(yǎng)，待孢子充分形成。取培養(yǎng)好的發(fā)酵固體物1 g，放入49 mL 0.5%的吐溫-80溶液中（加玻璃珠），震蕩混勻，設(shè)3次重復(fù)，取500 μL梯度稀釋，采用平板培養(yǎng)法進(jìn)行活菌計數(shù)，計算產(chǎn)孢量。

1.2.5 降解菌的ITS rDNA序列鑒定 取含孢子的斜面，接種至搖瓶，28℃，180 r/min培養(yǎng)24 h待生成菌絲球后取含菌絲的發(fā)酵液2 mL離心，植物基因組提取試劑盒（TIANGEN DP305）提取SSCL-5菌株的基因。ITS序列擴(kuò)增采用ITS1及ITS4序列引物，PCR擴(kuò)增測序。測序結(jié)果利用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件Clustal X及MEGA5.1構(gòu)建分類系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 草酸青霉SSCL-5對氯氰菊酯的降解率測定 準(zhǔn)確稱取0.0500 g氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈溶解至10 mL容量瓶（5 g/L），梯度稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。氯氰菊酯加入50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（終濃度為500 mg/L），接入對數(shù)生長期含菌絲發(fā)酵液5 mL，設(shè)置3個重復(fù)及無菌發(fā)酵液對照，28℃、180 r/min培養(yǎng)0 h、12 h、24 h。在帶菌體的發(fā)酵液中加入石油醚50 mL震蕩萃取1.5 h，轉(zhuǎn)入分液漏斗，取下層有機(jī)相，上層水相轉(zhuǎn)入三角瓶，萃取3次。將有機(jī)相合并，加入無水硫酸鈉，再轉(zhuǎn)入250 mL燒瓶，56℃旋轉(zhuǎn)負(fù)壓蒸發(fā)至干，分3次加入石油醚溶解，定容至20 mL，待HPLC測定［14］。HPLC檢測：色譜柱依利特C18柱，粒徑5 μm，流動相：水+乙腈（80∶20），流速：1 mL/min，檢測波長：235 nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35℃。

1.2.7 草酸青霉SSCL-5對其他菊酯類農(nóng)藥耐藥能力測定 文獻(xiàn)報道表明微生物對菊酯類農(nóng)藥降解具有廣泛性［15］。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入不同濃度（終濃度分別為50，100，150，200，250 mg/L）的氰戊菊酯（慶豐20%乳油）、聯(lián)苯菊酯（白拜5%乳油）、溴氰菊酯（順豐2.5%粉劑）、氯菊酯（衛(wèi)將25%粉劑）、氯氟氰菊酯（衛(wèi)豹10%粉劑），接入對數(shù)生長期含菌絲發(fā)酵液5 mL，28℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，觀察SSCL-5在該培養(yǎng)基中的生長情況。

1.2.8 菌劑制備及土壤室內(nèi)試驗驗證 將固體發(fā)酵物在35℃條件下烘干48 h。收集干燥物于氣流粉碎機(jī)中，按照工作5 min、停止2 min間歇模式進(jìn)行粉碎，粉碎至60目大小。將固體發(fā)酵孢子粉∶麩皮∶高嶺土=2∶4∶4，攪拌混合均勻，獲得菌劑。在尺寸為30 cm × 45 cm× 20 cm的土壤盒內(nèi)進(jìn)行室內(nèi)降解試驗。人工添加氯氰菊酯至土壤中，使土壤中氯氰菊酯含量達(dá)到400 mg/kg。加入菌劑40 g攪拌均勻。中間噴施補(bǔ)充水分，保持溫度20-34℃，濕度40%-60%條件，一個月之后測定土壤氯氰菊酯殘留量。

2 結(jié)果

2.1 氯氰菊酯降解菌的分離

經(jīng)選擇性梯度稀釋平板培養(yǎng)，分離獲得8株可耐受1 000 mg/L氯氰菊酯的微生物菌株。其中細(xì)菌菌株5株，真菌菌株3株。其對氯氰菊酯的利用率也有差異，需要對菌株降解能力進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

2.2 氯氰菊酯降解菌的篩選

8株可利用氯氰菊酯作為唯一碳源生長的菌株中，SSCL-5的降解效果最好，如表1所示。因此選取SSCL-5作為出發(fā)菌株，0 h、12 h及24 h后測定的氯氰菊酯殘留濃度，與空白對照相比，SSCL-5顯著的降低了氯氰菊酯在發(fā)酵液中的含量。氯氰菊酯初始濃度500 mg/L的發(fā)酵液，接種12 h后降解率即可達(dá)到47.9%，對照的自然降解率為16.1%。24 h時降解率達(dá)67.9%，對照為21.7%，據(jù)有極顯著差異（如圖1，t，P=0.000 003），由于測定方法的限制，在250 mg/L以下紫外分光光度計測定值不能反映發(fā)酵液中氯氰菊酯的真實含量，需要在HPLC中精確的檢測SSCL-5的實際降解效果。

表1 篩選菌株降解效果比較

2.3 氯氰菊酯降解菌SSCL-5的形態(tài)鑒定

氯氰菊酯降解菌SSCL-5在MA平板上生長稍緩慢、在CYA平板上生長快，菌絲短、絨狀，背面無色，生成墨綠色濃密孢子。鏡檢顯示其小梗平行排列，6-10個，孢子橢圓形（圖2），鑒定該菌為草酸青霉（Penicillium oxalicum）［16］。

2.4 氯氰菊酯降解菌SSCL-5的生長特性

該菌以孢子懸液接種，28℃，180 r/min培養(yǎng)，于12 h進(jìn)入對數(shù)生長期，大約在84 h進(jìn)入平臺期，平臺期可一直維持至96 h（圖3）。在固體發(fā)酵過程中，適當(dāng)?shù)牡練び欣谕?，使菌絲深入培養(yǎng)基，大量孢子一般形成于第7天，形成大約5×109個/g的孢子。

2.5 氯氰菊酯降解菌SSCL-5的ITS序列鑒定

經(jīng)ITS基因擴(kuò)增，測序后經(jīng)GenBank比對，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件Clustal X及MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），系統(tǒng)發(fā)育樹顯示該菌為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。將該序列提交基因GenBank，登錄號為：MK 163534。

2.6 草酸青霉SSCL-5對氯氰菊酯的降解率測定

HPLC檢測標(biāo)準(zhǔn)品后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=617.54x+203 2.1（R2=0.999 9），該曲線適用范圍為5 mg/L-1 000 mg/L。經(jīng)石油醚萃取-HPLC法測定，搖瓶發(fā)酵24 h后氯氰菊酯殘留量如圖5所示。12 h后氯氰菊酯在SSCL-5發(fā)酵液中殘留量為 56.9%，與對照具極顯著差異（t，P=0.024 8）。24 h后與SSCL-5發(fā)酵液中殘留量為0.2%，對照的殘留量為79.2%，具有極顯著差異（t，P= 0.000 109）。

圖1 不同濃度條件下SSCL-5菌株發(fā)酵0 h、12 h及24 h后氯氰菊酯的殘留量

圖2 SSCL-5菌株形態(tài)鑒定

2.7 草酸青霉SSCL-5對其他菊酯類農(nóng)藥降解能力測定

接種于不同濃度的5種菊酯類農(nóng)藥（氰戊菊酯、聯(lián)苯菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯）無機(jī)鹽培養(yǎng)基，其結(jié)果表明，草酸青霉SSCL-5具有廣泛的菊酯類農(nóng)藥的耐受能力，并且可能具有降解其他菊酯類農(nóng)藥的潛能，如表2、圖6所示。

圖3 SSCL-5菌株液體及固體生長特性

2.8 菌劑制備及土壤室內(nèi)試驗驗證

SSCL-5固體發(fā)酵后期形成大量深綠色孢子，與麩皮稻殼培養(yǎng)基等一起經(jīng)低溫烘干、間歇粉碎后形成棕色粉末。與麩皮、高嶺土的菌劑復(fù)配后形成淺棕色的菌劑。土壤室內(nèi)實驗中依照土壤重量的千分之一施用菌劑。為使草酸青霉孢子在土壤中的萌發(fā)及定殖，需要土壤保持相當(dāng)?shù)臐穸燃八缮⒍?。保持溫度?0-34℃之間，基本不會影響真菌的生長過程。可以在土壤盒內(nèi)觀察到白色菌絲迅速布滿土壤表面的過程。經(jīng)石油醚萃取-HPLC法測定，土壤中400 mg/L的氯氰菊酯被降解至133.31 mg/L，降解率達(dá)67.6%（表3）。延長測定時間或降低土壤中受測氯氰菊酯的原始含量有利于菌劑對氯氰菊酯的降解效果。

圖4 SSCL-5與模式菌株建樹

圖5 石油醚-HPLC法測定不同時間氯氰菊酯降解率

表2 草酸青霉對其他菊酯類農(nóng)藥的耐受

圖6 草酸青霉對其他菊酯類農(nóng)藥的耐受

表3 土壤室內(nèi)試驗氯氰菊酯殘留量及降解率

3 討論

近年來，大量農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程，一方面殺蟲劑的使用有效控制植物病害，提高作物產(chǎn)量，促進(jìn)了經(jīng)濟(jì)發(fā)展，另一方面農(nóng)藥的使用和濫用引起了關(guān)注［17］。殘留于土壤中的農(nóng)藥一部分發(fā)生降解轉(zhuǎn)化，另一部分或累積于土壤、或被植物吸收、或揮發(fā)進(jìn)入大氣、或進(jìn)入地表、地下水［18-19］。農(nóng)藥殘留物引起生態(tài)毒理、遺傳毒性和細(xì)胞毒性、發(fā)育和生殖毒性、畸形或慢性毒性等問題［20］。研究表明氯氰菊酯在土壤中的消解動態(tài)均符合一級動力學(xué)方程，原始沉積量與施藥量、施藥次數(shù)密切相關(guān)［21］。

微生物法降解土壤殘留農(nóng)藥對于恢復(fù)生態(tài)環(huán)境、降低脊椎動物風(fēng)險具有重要意義［22-23］。目前發(fā)現(xiàn)的對菊酯類農(nóng)藥具有降解能力的微生物包括細(xì)菌：如無色桿菌屬（Achromobactersp.）［24］、芽孢桿菌（Bacillussp.）［25］、固氮弧菌（Azoarcus indigens）［26］、梭狀芽孢桿菌（Clostridiumsp.）［27］、鞘氨醇菌屬（Sphingobiumsp.）［28］、克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）［29］、沙雷氏屬（Serratiasp.）［30］、酸單胞菌屬（Acidomonassp.）［31］、假單胞菌（Pseudomonassp.）［32］等 ；放線菌：如鏈霉菌（Streptomycessp.）［33］等及真菌如黑曲霉（Aspergillus niger）［34］、木霉屬（Trichoderma viridae）［35］、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysoporium）［35］、菌膜假絲酵母（candida pelliculosa）［36］等。而大部分菌株在搖瓶內(nèi)有效降解范圍低于100 mg/L。Tallur等［37］報道微球菌屬（Micrococcussp.）菌株CPN-1可將1 000 mg/L的氯氰菊酯在8 d內(nèi)降解90%。Zhao等［38］報道小鏈小桿菌屬（Catellibacteriumsp.）菌株CC-5可將500 mg/L的氯氰菊酯在7 d內(nèi)降解56%。在室內(nèi)土壤實驗中據(jù)Akbar等人報道氯氰菊酯（200 mg/L），在42 d內(nèi)可被醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌株MCm531、鞘氨醇菌屬（Sphingomonassp.）菌株RCm6、副短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）菌株FCm9、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）菌株JCm2、紅球菌屬（Rhodococcussp.）菌株JCm5或人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropic）菌株JCm1降解90% 以上［39-40］。Chen等［41］報道在田間試驗中金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）菌株HP-S-01可將氯氰菊酯（50 mg/L）降低81.1%。Tallur、Zhao及Chen等［36-38，41］均研究了氯氰菊酯在細(xì)菌（微球菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、地衣芽孢桿菌和鞘氨醇單胞菌）中的降解途徑。細(xì)菌主要通過羧酸酯酶的酯鍵水解作用產(chǎn)生羧酸和醇。經(jīng)過羧酸酯酶的作用可將氯氰菊酯水解，3-苯氧基苯甲酸是氯氰菊酯細(xì)菌降解的的主要代謝產(chǎn)物之一。而3-苯氧基苯甲酸屬雌激素類物質(zhì)，具有相當(dāng)?shù)纳扯拘裕?2］。在本研究中除草酸青霉SSCL-5也發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、無色桿菌（Achromobactersp.）、噬線沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）等菌株，對氯氰菊酯具有一定的降解性能。但部分菌株具有條件致病性如陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）等，部分不形成孢子的細(xì)菌例如鞘氨醇桿菌（Sphingobacteriumsp.）、韓國假單胞菌（Pseudomonas koreensis）等，均不利于應(yīng)用型研究的開展。目前有關(guān)真菌降解菊酯類農(nóng)藥的研究報道不多，但真菌可產(chǎn)生大量孢子有利于生產(chǎn)制備及其在土壤環(huán)境中定殖。真菌孢子的生長速度及其孢子數(shù)量的多少決定了其在土壤中定殖能力的大小及微生物菌劑制備成本的高低，生長速度越快形成孢子數(shù)量越高則越有利于其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。因此草酸青霉的代謝途徑有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究采用多重篩選方法從70余份土壤中獲得一株高效分解利用菊酯類農(nóng)藥的微生物菌株SSCL-5，該菌株可在含1 000 mg/L的氯氰菊酯無機(jī)鹽培養(yǎng)基中正常生長。經(jīng)鑒定確定該菌為草酸青霉（Penicillium oxalicum），產(chǎn)深綠色孢子。經(jīng)紫外分光光度法及HPLC證實，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基（氯氰菊酯400 mg/L）、28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h的條件下，草酸青霉SSCL-5對氯氰菊酯的降解率為97%?？稍诤渌喾N菊酯類農(nóng)藥的培養(yǎng)基中正常生長。土壤室內(nèi)試驗證明，在土壤中，溫度20-34℃、水分含量保藏40%-60%，30 d條件下，草酸青霉SSCL-5可將土壤中400 mg/L的氯氰菊酯降解67.6%。顯示了該菌株在解決氯氰菊酯在土壤殘留問題中的潛能。