一株敵草隆降解菌的分離及其應(yīng)用潛能探索

岳麗曉 李登云 張晶晶 仝雷

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，鄭州 451100）

除草劑的廣泛使用，在保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中做出了巨大的貢獻(xiàn)。但除草劑的過量及不恰當(dāng)使用也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，導(dǎo)致各種除草劑在土壤和水體環(huán)境中被普遍檢出［1］。敵草?。∟-（3，4-dichlorophenyl）-N，N-dimethylurea）是一種高效選擇性除草劑，主要通過雜草根部被吸收，也可以被莖、葉吸收，通過抑制雜草的光合作用而使雜草死亡（通過阻斷光合系統(tǒng)II中質(zhì)體醌的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止電子向質(zhì)體醌的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制光合作用），可有效防除大多數(shù)一年生和多年生雜草，在棉花、大豆、花生、玉米、黃瓜、果樹、咖啡、糖甘蔗和柑橘等的生產(chǎn)中均有較好的應(yīng)用［2-4］。

敵草隆自1954年進(jìn)入市場(chǎng)至今，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。由于其難溶于水且穩(wěn)定性較好，導(dǎo)致其容易在環(huán)境中長(zhǎng)期積累，在土壤與水體中均有檢出報(bào)道［5］。在土壤中，敵草隆的殘留周期從幾個(gè)月到一年；而由于使用過程中的過量施用、雨水沖刷，導(dǎo)致敵草隆進(jìn)入水體環(huán)境，對(duì)水生生物及飲用水造成巨大威脅［6］。因此，敵草隆對(duì)環(huán)境及人體健康的影響受到了廣泛的關(guān)注。已有研究表明，敵草隆的接觸對(duì)眼睛和皮膚具有較強(qiáng)的刺激作用，同時(shí)，敵草隆暴露實(shí)驗(yàn)表明，敵草隆還具有致癌、致突變及影響代謝過程的毒性［7］；同時(shí)，敵草隆還可影響環(huán)境生物的多樣性，從而破壞生態(tài)系統(tǒng)［4］。敵草隆及其代謝中間產(chǎn)物3，4-二氯苯胺（3，4-dichloroaniline）在已有的報(bào)道中已被列為主要的水體污染物［8］。歐盟已將敵草隆列為歐洲淡水資源中的“優(yōu)先控制污染物”［2］。因此，如何高效的將敵草隆從環(huán)境中去除正逐漸成為環(huán)境安全的重要研究課題。

生物降解通常利用可以特定種類污染物作為唯一碳源、氮源或能源的微生物對(duì)污染物進(jìn)行逐步的酶解、利用，從而實(shí)現(xiàn)污染物的分解，被認(rèn)為是高效、環(huán)境友好且低成本的污染物去除方式［9-10］。隨著敵草隆使用導(dǎo)致的環(huán)境污染的大量報(bào)道及敵草隆毒性研究的深入，敵草隆的生物降解受到了廣泛的關(guān)注，敵草隆降解菌得到了一定量分離與報(bào)道。已報(bào)道的敵草隆降解菌來自芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［2］、Variovarax sp.［11］、微球菌屬（Micrococcussp.）［12］等，還包括一些真菌如靈芝菌屬（Ganodermasp.）［13］、曲霉菌屬（Aspergillussp.）［14］、小克銀漢霉菌屬（Cunninghamellasp.）［15］、被孢霉菌屬（Mortierellasp.）［16］、脈孢菌屬（Neurosporasp.）［17］等。值得注意的是，目前獲得敵草隆的降解菌數(shù)量相對(duì)較少，降解機(jī)理研究還不充分，且菌株在實(shí)際敵草隆污染環(huán)境中修復(fù)應(yīng)用探索較少。

本研究自長(zhǎng)期使用敵草隆的棉花地土壤中分離獲得到一株能以敵草隆為唯一碳源生長(zhǎng)的高效降解菌LX-C-06，通過菌落形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析與確定菌株LX-C-06為木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）。通過單因素分析對(duì)菌株的環(huán)境適應(yīng)性展開了系統(tǒng)的研究，并基于代謝中間產(chǎn)物分析推測(cè)了菌株對(duì)敵草隆的代謝途徑，進(jìn)一步通過模擬原位土壤修復(fù)試驗(yàn)探索了菌株在實(shí)際應(yīng)用中的潛能，旨在豐富敵草隆降解菌資源，為敵草隆污染環(huán)境的生物修復(fù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究中所使用的敵草隆降解菌LX-C-06為本實(shí)驗(yàn)室自行分離、保存，實(shí)驗(yàn)中使用的感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌Escherichia coliDH5α購自生工生物工程（上海）股份有限公司，基因克隆用的載體（pMD18-T）購自TaKaRa公司。

1.1.2 試劑 敵草隆原藥（分析純，99%）購自上海麥克林生化科技有限公司，以色譜純甲醇配制為1×105mg/L的母液備用，使用時(shí)根據(jù)所需濃度進(jìn)行添加；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉等試劑均購自Amresco公司；化學(xué)試劑如NaCl、KH2PO4、CaCl2等均購自國藥集團(tuán)；基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及PCR反應(yīng)所需的DNA聚合酶等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇為色譜純，購自上海麥克林生化科技有限公司；引物合成及測(cè)序均委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

1.1.3 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽離子培養(yǎng)基（MSM）：（NH4）2SO41.5 g/L，MgCl20.05 g/L，CaCl20.02 g/L，KH2PO41.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，K2SO41.0g/L，NaCl 5.0 g/L，調(diào)整pH至7.0±0.2，定容后滅菌備用。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，NaCl 10.0 g/L，MgCl20.05 g/L，CaCl20.02 g/L，調(diào)整pH至7.0±0.2，定容后滅菌備用。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)整pH至7.0±0.2，定容后滅菌備用。

所有培養(yǎng)基的滅菌均在121℃條件下滅菌30min完成，如需使用固體培養(yǎng)基，在配制完成后加入1.2%（W/V）的瓊脂粉后滅菌即可得。

1.2 方法

1.2.1 敵草隆降解菌的富集與分離 土壤樣品取至河南省安陽市白璧鎮(zhèn)長(zhǎng)期種植棉花且有敵草隆使用記錄的棉田（北緯 36°06'85″，東經(jīng) 114°50'68″），去除表層土壤后，取底下5-10 cm處的土壤裝入自封袋后置于4℃冰盒中保存并迅速送回實(shí)驗(yàn)室，置于4℃冰箱保存、備用。取1.0 g土壤樣品，加入100 mL 富集培養(yǎng)基（液體，含敵草隆50 mg/L）中，于30℃條件下避光震蕩培養(yǎng)（160 r/min）。培養(yǎng)5 d后，取10 mL培養(yǎng)液加入新鮮的100 mL 富集培養(yǎng)基（液體）中并提高敵草隆濃度至100 mg/L，在上述相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)。重復(fù)上述轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)方法，并每次提高敵草隆濃度50 mg/L至最終濃度達(dá)到400 mg/L。

取最終富集的培養(yǎng)液進(jìn)行劃線至無機(jī)鹽離子固體培養(yǎng)基上（含50 mg/L敵草?。?0℃條件下避光培養(yǎng)3 d，挑取單菌落接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h（30℃，160 r/min）。取獲得的菌液1 mL在7 000 r/min條件下離心3 min，棄上清，獲得的菌體沉淀用新鮮的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基沖洗后再次離心（7 000 r/min，3 min）。重復(fù)洗滌3次后用1 mL新鮮的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基將菌體重懸浮，用于降解能力測(cè)定。將重懸浮的菌液接種至10 mL無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基（含50 mg/L敵草隆）作為處理組，以相同條件下不接入菌液的10 mL無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基（含50 mg/L敵草隆）作為對(duì)照組，將處理組與對(duì)照組于30℃條件下避光震蕩培養(yǎng)（160 r/min）5 d后取樣，檢測(cè)敵草隆濃度并計(jì)算菌株對(duì)敵草隆的降解率（計(jì)算公式：降解率（%）=100×（對(duì)照組中敵草隆濃度-處理組中敵草隆濃度）/對(duì)照組中敵草隆濃度）。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，直至獲得穩(wěn)定、高效降解敵草隆的微生物菌株。

1.2.2 敵草隆降解菌的鑒定 首先，對(duì)獲得的降解菌進(jìn)行16S rRNA基因序列的克隆與測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，具體如下：將獲得的敵草隆降解菌接種LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)菌株進(jìn)行基因組提取。以獲得的基因組為模板進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增使用通用引物27F和1492R，PCR反應(yīng)條件為：（1）95℃3 min，（2）95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1.5 min，重復(fù)34次，（3）72℃ 10 min，4℃ 60 min。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，回收片段連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α后提取質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行載體去除后進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，從微生物標(biāo)準(zhǔn)命名數(shù)據(jù)庫（LPSN，http：//www.bacterio.net/）下載標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析，使用MEGA 7.0軟件的NJ法進(jìn)行（Bootstrap value = 1 000）［18］。

同時(shí)，基于《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)獲得菌株的生理生化特征進(jìn)分析，具體實(shí)驗(yàn)方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［19-20］。

1.2.3 菌株的降解特性研究 菌株的降解特性研究包括菌株對(duì)環(huán)境因素溫度、pH及鹽離子濃度的耐受能力，對(duì)不同濃度敵草隆的降解能力。首先，將獲得的降解菌接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.8，取1 mL菌液進(jìn)行離心洗滌（參考1.2.1中離心洗滌方法）作為種子。菌株對(duì)環(huán)境因素溫度、pH及鹽離子濃度的耐受能力測(cè)定方法如下：（1）以10%的接種量將菌種接種至pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基（均含50 mg/L敵草?。┲凶鳛樘幚斫M，以相同pH條件下的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基不接入菌種作為對(duì)照組，處理組與對(duì)照組均在30℃條件下避光震蕩（160 r/min）培養(yǎng)，每24h測(cè)定一次敵草隆濃度；（2）以10%的接種量將菌種接種至pH為7.0的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基（含50 mg/L敵草?。┲凶鳛樘幚斫M，以相同條件下的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基不接入菌種作為對(duì)照組，處理組與對(duì)照組分別在10℃、20℃、30℃、40℃和50℃條件下避光震蕩（160 r/min）培養(yǎng)，每24 h測(cè)定一次敵草隆濃度；（3）以10%的接種量將菌種接種至pH為7.0的NaCl濃度分別為1%、3%、5%、7%、9%和12%（W/V）無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基（各含50 mg/L敵草?。┲凶鳛樘幚斫M，以相同條件下的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基不接入菌種作為對(duì)照組，處理組與對(duì)照組均在30℃條件下避光震蕩（160 r/min）培養(yǎng)，每24 h測(cè)定一次敵草隆濃度。最后，以10%的接種量將菌種接種至分別含100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L和1 000 mg/L敵草隆的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基（pH 7.0）中作為處理組，以相同敵草隆濃度條件下的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基不接入菌種作為對(duì)照組，處理組與對(duì)照組均在30℃條件下避光震蕩（160 r/min）培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后測(cè)定殘留敵草隆濃度并計(jì)算敵草隆降解率。上述所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，并根據(jù)1.2.1中降解率計(jì)算公式計(jì)算敵草隆的降解率。

1.2.4 菌株對(duì)敵草隆的代謝途徑研究 以10%的接種量將菌種接種至分別10 mL含50 mg/L敵草隆的無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基（pH 7.0）中，在30℃條件下避光震蕩（160 r/min）培養(yǎng)，每24 h取樣一次。樣品以等體積正己烷萃取2次后將有機(jī)相合并，合并后的有機(jī)相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后，用5 mL色譜純的甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于代謝中間產(chǎn)物的質(zhì)譜分析。采用LC-MS對(duì)代謝中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，具體如下：安捷倫LC-MS（6420），流動(dòng)相為甲醇（100%），直接進(jìn)樣法（1 μL），檢測(cè)模式為負(fù)離子檢測(cè)模式，使用安捷倫Mass Hunter（v A.02.00）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析，采集信號(hào)范圍為100-400 m/z。基于已有的報(bào)道結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果，獲得菌株降解敵草隆的代謝中間產(chǎn)物，進(jìn)而推測(cè)菌株對(duì)敵草隆的代謝途徑。

1.2.5 菌株在模擬土壤修復(fù)中的應(yīng)用 將獲得的降解菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=1.0，離心后收集菌體，以無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基沖洗（參考1.2.1），并以等體積的新鮮MSM重懸浮作為種子（約為5.7×106CFU/mL）。取鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)花園土壤作為供試土壤，將土壤用20目篩子過篩去除土壤中的石子等大顆粒物質(zhì)后備用。根據(jù)目標(biāo)濃度將敵草隆母液加入10 g土壤中，充分?jǐn)嚢韬笤谕L(fēng)櫥中進(jìn)行甲醇揮發(fā)12 h，從而獲得模擬的敵草隆污染土壤。分別向10 g滅菌（121℃，30 min，反復(fù)2次）和未滅菌的土壤中加入敵草隆至終濃度為50 mg/kg（參照前述進(jìn)行甲醇揮發(fā)處理），加入1mL降解菌的種子溶液，與土壤進(jìn)行充分混合，做為處理組，同時(shí)以10 g滅菌（121℃，30 min，反復(fù)2次）和未滅菌的土壤中加入敵草隆至終濃度為50 mg/kg但不接入降解菌作為對(duì)照組，將處理組與對(duì)照至于恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱中，在30℃、相對(duì)濕度50%、光照12 h、黑暗12 h條件下培養(yǎng)，每5 d取樣一次，取樣至30 d，測(cè)定殘留敵草隆濃度并計(jì)算降解率，上述所有實(shí)驗(yàn)組與處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.6 分析與統(tǒng)計(jì)方法 基于氣相色譜法對(duì)樣品中敵草隆濃度進(jìn)行測(cè)定。使用島津氣相色譜（GC-2010）建立敵草隆檢測(cè)方法，具體如下：色譜柱為Wonda Cap（10.25 mm×30 m×0.25 μm），進(jìn)樣扣溫度為260℃，色譜柱采取程序升溫方式（200℃保持2min，20℃/min升溫至240℃保持4 min），檢測(cè)器溫度為280℃，載氣為高純氮?dú)猓?9.999%），氣體流速為2 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL，使用電子捕獲檢測(cè)器（ECD）。以敵草隆標(biāo)準(zhǔn)溶液配制梯度濃度溶液，建立濃度與峰面積間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，氣相色譜對(duì)50 mg/L敵草隆的檢測(cè)結(jié)果（保留時(shí)間為3.67 min）、2-10 mg/L和10-50 mg/L濃度區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

對(duì)于土壤中的敵草隆，以正己烷作為萃取劑，每10 g土壤中加入10 mL正己烷，在密封條件下充分混勻后進(jìn)行超聲震蕩混勻1 h，取有機(jī)相（1）；將剩余的土壤樣品再次重復(fù)上述萃取步驟，并最終獲得有機(jī)相（2）；將最終獲得的土壤樣品進(jìn)行濾紙過濾，用正己烷對(duì)樣品進(jìn)行淋洗，大約30-50 mL，收集濾液作為有機(jī)相（3）。最終，將有機(jī)相（1）、（2）和（3）合并，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并用甲醇復(fù)溶至10 mL用于敵草隆檢測(cè)。同時(shí)，測(cè)得土壤中敵草隆（濃度范圍為5-50 mg/L）提取的回收效率均在96%以上。

圖1 氣相色譜對(duì)敵草隆的檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果

2.1 敵草隆降解菌的分離與鑒定

經(jīng)過多次對(duì)采集土壤樣品的富集、馴化與分離，篩選到一株可將無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基中的敵草隆為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，并在5 d內(nèi)對(duì)無機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基中50 mg/L敵草隆的降解率為100%，將菌株命名為L(zhǎng)X-C-06。菌株LX-C-06在LB固體培養(yǎng)基上呈黃色，菌落為邊緣規(guī)則的圓形且表面光滑（圖2），對(duì)菌株的生理生化特征分析結(jié)果如表1所示。

圖2 菌株LX-C-06在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

表1 菌株LX-C-06的生理生化特征

對(duì)菌株LX-C-06進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增后獲得的片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示PCR獲得的片段長(zhǎng)度為1 455 bp，將獲得的序列與NCBI中已有的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)并將序列提交至NCBI的GenBank（登錄號(hào)為：MN262087），結(jié)果顯示菌株LX-C-06的16S rRNA基因序列與無色桿菌屬（Achromobactersp.）細(xì)菌的16S rRNA基因序列具有較高的相似性，進(jìn)一步從標(biāo)準(zhǔn)菌株命名數(shù)據(jù)庫（LPSN）中下載無色桿菌屬細(xì)菌所有模式菌株的16S rRNA基因序列，并以Raoultella ornithinolyticaZK4的16S rRNA基因序列為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示，菌株LX-C-06與木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）的親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步結(jié)合菌株的生理生化特征，確定菌株LX-C-06為木糖氧化無色桿菌。

2.2 菌株LX-C-06對(duì)敵草隆的降解特性

環(huán)境pH值對(duì)LX-C-06降解敵草隆的影響如圖4-A所示，可以看出，當(dāng)pH為7.0時(shí)，菌株120 h對(duì)敵草隆的降解率最高為100%；同時(shí)，當(dāng)pH為6.0和8.0時(shí)，菌株120 h對(duì)敵草隆的降解率均大于80%（分別為80.1%和90.7%）；當(dāng)pH過酸或者過堿時(shí)，菌株的降解能力受到顯著抑制，pH5.0和9.0條件下菌株120 h對(duì)敵草隆的降解率分別為12.8%和36.2%；同時(shí)，基于上述結(jié)果可以看出相對(duì)酸性條件，菌株對(duì)堿性條件有更好的適應(yīng)能力。

培養(yǎng)溫度對(duì)菌株LX-C-06降解敵草隆的影響如圖4-B所示，由圖可知，菌株LX-C-06的最佳降解溫度為30℃，且菌株對(duì)溫度有較寬的耐受范圍。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，120 h對(duì)50 mg/L敵草隆的降解率為100%，而當(dāng)溫度為20℃和40℃時(shí)，120 h對(duì)50 mg/L敵草隆的降解率分別為47.5%和63.0%。當(dāng)溫度過高（50℃）或過低（10℃）時(shí)，菌株對(duì)敵草隆的降解受到顯著抑制，120 h對(duì)50 mg/L敵草隆的降解率分別為降解率僅為10.8%和5.6%。

圖3 菌株LX-C-06的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株LX-C-06在不同鹽離子濃度條件下對(duì)敵草隆的降解情況如圖4-C所示，當(dāng)NaCl濃度為1-3%時(shí)，菌株120 h內(nèi)對(duì)50 mg/L敵草隆的降解未受到影響（降解率均為100%）；當(dāng)NaCl濃度為5%時(shí)，菌株120 h內(nèi)對(duì)50 mg/L敵草隆的降解未受到顯著影響（降解率為87.8%）；隨著NaCl濃度的逐漸提高，菌株對(duì)敵草隆的降解能力受到顯著抑制，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到12%時(shí)，菌株的降解能力被完全抑制（降解率為 0）。

菌株LX-C-06在120 h對(duì)不同濃度敵草隆的降解率如圖4-D所示，可以看出，當(dāng)敵草隆濃度≤400 mg/L時(shí)，菌株LX-C-06在120 h對(duì)敵草隆的降解率均為100%；當(dāng)敵草隆濃度升高至600 mg/L時(shí)，菌株LX-C-06對(duì)敵草隆的降解能力并未受到顯著影響，在120 h對(duì)敵草隆的降解率為92.1%；當(dāng)敵草隆濃度大于600 mg/L后，菌株對(duì)敵草隆的降解能力受到顯著影響，當(dāng)敵草隆濃度為800 mg/L和1 000 mg/L時(shí)，菌株120 h對(duì)敵草隆的降解率僅為51.2%和13.9%。

2.3 菌株LX-C-06降解敵草隆的代謝中間產(chǎn)物及代謝途徑分析

對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)獲得的質(zhì)荷比（m/z）、可能代謝中間產(chǎn)物的分子量（M.W.）并結(jié)合已有敵草隆降解相關(guān)報(bào)道，推測(cè)質(zhì)譜檢測(cè)獲得的敵草隆降解中間產(chǎn)物包括3，4-二氯苯 胺（3，4-dichloroaniline，3，4-DCA，m/z=161.1，M.W.=162）、1，2-二氯苯（1，2-dichlorobenzene，1，2-DCB，m/z=146.2，M.W.=147）、4，5-二氯兒茶酚（dichlorocatechol，4，5-DCC，m/z=178.0，M.W.=179）、3，4-二氯-3-烯-1，6-己二醇（3，4-dichlorohex-3-ene-1，6-diol，3，4-DCHED，m/z=184.1，M.W.=185）和3-氯-4-酮基-己二酸（3-chloro-4-oxohexanedioic acid，3C4OHDA，m/z=193.3，M.W.=194）（圖 5-A）。

根據(jù)質(zhì)譜分析的敵草隆降解中間產(chǎn)物，推測(cè)菌株LX-C-06降解敵草隆的代謝途徑為：敵草隆經(jīng)水解酯鍵生成3，4-二氯苯胺，3，4-二氯苯胺則經(jīng)脫氨基作用生成1，2-二氯苯，而1，2-二氯苯則在羥基化后生成4，5-二氯兒茶酚，4，5-二氯兒茶酚在兩個(gè)羥基之間開環(huán)生成3-氯-4-酮基-己二酸（圖5-B）。結(jié)合已有的報(bào)道，可以推測(cè)3-氯-4-酮基-己二酸進(jìn)一步通過2-氯琥珀酸脫氯轉(zhuǎn)化為琥珀酸而被生物體所利用。

圖4 菌株LX-C-06對(duì)敵草隆的降解特性

2.4 菌株LX-C-06在模擬土壤修復(fù)中的應(yīng)用

經(jīng)過30 d內(nèi)連續(xù)7次的采樣與檢測(cè)（圖6），可以看到隨著時(shí)間的發(fā)展，在未添加菌株LX-C-06情況下，滅菌土壤和未滅菌土壤中敵草隆濃度均無顯著變化，這表明在自然條件下敵草隆降解緩慢；在添加了菌株LX-C-06情況下，滅菌土壤和未滅菌土壤中的敵草隆濃度均逐漸降低，且未滅菌土壤中敵草隆濃度降低的速度快于滅菌土壤中敵草隆濃度的降低速度，培養(yǎng)的30 d后未滅菌土壤和滅菌土壤中敵草隆的降解率分別為78.1%和90.7%，結(jié)果表明添加菌株LX-C-06可顯著的促進(jìn)敵草隆在環(huán)境中的降解。

圖5 菌株LX-C-06降解敵草?。?8 h）代謝中間產(chǎn)物質(zhì)譜分析（A）及推測(cè)的代謝途徑（B）

3 討論

隨著敵草隆在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大量使用，其在環(huán)境中的農(nóng)藥殘留問題日益嚴(yán)重，對(duì)人體健康及生態(tài)環(huán)境安全的威脅也日益突出。在特定環(huán)境中長(zhǎng)期使用某種農(nóng)藥會(huì)對(duì)該環(huán)境中微生物的種群結(jié)構(gòu)及數(shù)量帶來巨大影響，同時(shí)，也會(huì)對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行馴化，導(dǎo)致可降解、利用這些異源物質(zhì)的微生物成為優(yōu)勢(shì)物種，或可導(dǎo)致微生物發(fā)生進(jìn)化而能降解周邊的農(nóng)藥［21］。因此，從長(zhǎng)期使用敵草隆的環(huán)境中分離降解菌成為敵草隆降解菌資源獲得的重要方法。

圖6 土壤中敵草隆濃度

本研究從長(zhǎng)期使用敵草隆除草劑的棉花田中采集土壤樣品，經(jīng)過多次富集、馴化，最終分離獲得了一株可高效降解敵草隆的微生物菌株LX-C-06，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析確定菌株為木糖氧化無色桿菌，這也是首次分離、獲得可降解敵草隆的無色桿菌。通過單因素試驗(yàn)法分析了不同環(huán)境因素對(duì)菌株LX-C-06降解敵草隆能力的影響，確定了最適降解溫度和pH值分別為30℃和7.0；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株可耐受較高濃度的NaCl，在NaCl濃度≤7%時(shí)，均可高效降解敵草?。磺揖陮?duì)較高濃度的敵草隆同樣表現(xiàn)出良好的降解能力，當(dāng)敵草隆濃度≤600 mg/L時(shí)，降解率均在90%以上。

菌株LX-C-06對(duì)敵草隆的代謝途徑與已有報(bào)道的微生物降解敵草隆代謝途徑相似，均是通過酯鍵的水解將敵草隆轉(zhuǎn)化為3，4-二氯苯胺，進(jìn)一步通過逐步的脫氨、羥基化、開環(huán)等過程，最終生成琥珀酸被生物體所利用。已有報(bào)道的菌株Bacillus licheniformisSDS12是一株可高效降解敵草隆的植物內(nèi)生菌，基于LC-MS的分析發(fā)現(xiàn)該菌通過相同途徑將敵草隆進(jìn)行逐步轉(zhuǎn)化利用［2］。分離自甘蔗地的Neurospora intermediaDP8-1同樣通過3，4-二氯苯胺代謝途徑對(duì)敵草隆進(jìn)行降解，同時(shí)作者開展了菌株DP8-1在敵草隆生物修復(fù)中的應(yīng)用探索［17］。這些研究結(jié)果表明基于代謝中間產(chǎn)物3，4-二氯苯胺的代謝途徑可能是普遍存在于敵草隆降解菌中的代謝途徑，這也為進(jìn)一步闡明敵草隆在環(huán)境中的轉(zhuǎn)化過程及克隆獲得參與敵草隆降解的相關(guān)基因提供了重要的理論參考。

在模擬土壤原位修復(fù)的探索中，菌株LX-C-06同樣表現(xiàn)出良好的降解性能，30 d內(nèi)對(duì)土壤中50 mg/kg敵草隆的最高降解率為90.7%。同時(shí)，值得注意的是，未滅菌的土壤中敵草隆的降解率高于滅菌土壤中的敵草隆的降解率，這可能的原因是土壤中的原有微生物對(duì)敵草隆的降解具有協(xié)同、促進(jìn)作用，這在已有報(bào)道的其他污染物生物降解過程中有類似情況［21-23］，這表明菌株LX-C-06具有良好的應(yīng)用潛能。

4 結(jié)論

從長(zhǎng)期使用敵草隆的棉花田土壤中分離獲得了一株可高效降解敵草隆的降解菌LX-C-06，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，確定了該菌為木糖氧化無色桿菌。菌株LX-C-06對(duì)環(huán)境溫度、pH值及NaCl濃度均表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性。通過代謝中間產(chǎn)物的質(zhì)譜分析確定了菌株LX-C-06對(duì)敵草隆的代謝途徑，并通過模擬原位土壤修復(fù)探索了菌株的實(shí)際應(yīng)用潛能。本研究從菌株降解特性、污染物代謝途徑及菌株應(yīng)用潛能3個(gè)方面對(duì)菌株LX-C-06對(duì)敵草隆的降解及應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明菌株LX-C-06對(duì)敵草隆具有高效降解能力、良好的環(huán)境適應(yīng)性及較好的應(yīng)用潛能。