生防細菌ML-3抗菌蛋白發(fā)酵條件的優(yōu)化及其防治應(yīng)用

李靜舒 趙佳

（1. 山西廣播電視大學(xué)，太原 030027；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原030031）

隨著馬鈴薯成為繼水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物和精深加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，其種植面積在我國乃至全世界均呈現(xiàn)擴增趨勢，但各種植區(qū)由馬鈴薯早疫病引起的減產(chǎn)現(xiàn)象時有發(fā)生，發(fā)生嚴重時減產(chǎn)可達70%-80%［1-2］。馬鈴薯早疫病是一種由茄鏈格孢菌（Alternaria solani）引起的世界性病害，屬氣傳、土傳多循環(huán)流行性病害，發(fā)病嚴重時不僅導(dǎo)致葉片提前枯萎，嚴重阻礙光合作用造成減產(chǎn)，而且其分生孢子適應(yīng)性較強，易形成二次為害，對各地馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有較大影響［3-5］。為有效防治馬鈴薯早疫病的發(fā)生，研究者已從病原鑒定［6］、種植區(qū)病原遺傳結(jié)構(gòu)［1-2，7］、qPCR 快速檢測方法［8-9］、致病性［10］、抗藥性［11］、抗性品種篩選［12-13］、拮抗微生物篩選［14-15］和化學(xué)防治藥劑篩選［16-17］等方面進行了大量研究，使得人們在一定程度上明確了該病害的典型癥狀、發(fā)病規(guī)律、化學(xué)防治藥劑、病原檢測方法和部分地區(qū)抗藥性水平；了解了生物防治在該病害防治中的應(yīng)用潛力。然而，由于抗性品種選育和生物防治技術(shù)開發(fā)進程緩慢，目前該病害仍以化學(xué)防治為主，但由于病原抗藥性產(chǎn)生和部分產(chǎn)區(qū)病害逐年嚴重［18］，人們不得不加大防治藥劑用量或施藥次數(shù)，這些化學(xué)農(nóng)藥的大量和不合理使用導(dǎo)致化學(xué)防治的弊端（農(nóng)田生態(tài)結(jié)構(gòu)破壞、抗病抗藥性增強和農(nóng)藥殘留等）日益突出［18］。

生物防治作為一種以生物體或其活性產(chǎn)物為農(nóng)藥的防治措施，是緩解化學(xué)防治問題的重要途徑之一［19］。近年來，為突破該病害生物防治技術(shù)，國外已在植物天然產(chǎn)物［20］、拮抗微生物篩選及制劑［21］和殼聚糖防?。?2］上開展了大量研究工作，但我國有關(guān)馬鈴薯早疫病的生物防治研究還較為落后，雖然楊繼業(yè)等［14］、楊登路等［15］和王聰［23］對該病原的拮抗微生物和植物天然抑菌產(chǎn)物室內(nèi)活性進行了報道，但相關(guān)結(jié)果因缺乏田間藥效試驗環(huán)節(jié)而不能有效證實其田間應(yīng)用價值，而田間防效良好又是其制劑化之前的必要條件。因此，本研究一方面對前期篩選出的拮抗細菌ML-3產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，旨在為其后期工業(yè)化發(fā)酵提供參考依據(jù)；另一方面，對該抗菌蛋白的抑菌穩(wěn)定性和田間防效進行測定，旨在評價該菌株抗菌蛋白的田間應(yīng)用潛力，并為其后期制劑化研究和田間應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 拮抗細菌ML-3（分離自馬鈴薯植株莖部）和馬鈴薯早疫病病原（由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所采后病理室提供）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 NA固體培養(yǎng)基、NB發(fā)酵液和PDA培養(yǎng)基配制均參照高振峰［24］描述的方法。

1.2 方法

1.2.1 基于16S rRNA序列分析的菌株ML-3分子鑒定 參照Gao等［25］描述的方法進行菌株ML-3的基因組DNA提取、16S rDNA序列擴增測序和序列比對，隨后選擇近緣模式菌株16S rDNA序列使用MEGA 5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌株ML-3抗菌蛋白最佳硫酸銨鹽析濃度測定 （1）無菌發(fā)酵液制備：菌株ML-3經(jīng)NB發(fā)酵液于30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后終止發(fā)酵，12 000 r/min離心10 min去除菌體收集上清液，用于抗菌蛋白提取。（2）最佳鹽析濃度篩選：取無菌發(fā)酵液1 000 mL，參照張曉宇等［26］描述的方法，逐級加入不同飽和度硫酸銨，各級硫酸銨用量分別為114 g/L（20%）、243 g/L（40%）、390 g/L（60%）、561 g/L（80%）和767 g/L（100%），并對不同飽和度下的蛋白進行提取、透析、濃縮和冷凍干燥，獲得抗菌蛋白干粉后于4℃保存?zhèn)溆谩＃?）各級沉淀蛋白抑菌活性測定：以馬鈴薯早疫病菌為靶標，采用瓊脂擴散法［27］對各級沉淀蛋白的抑菌活性進行測定，從而篩選出菌株ML-3抗菌蛋白的最佳硫酸銨沉淀飽和度。

1.2.3 拮抗細菌ML-3胞外產(chǎn)抗菌蛋白培養(yǎng)液配方優(yōu)化

1.2.3.1 種子發(fā)酵液制備 于超凈工作臺中，用接種環(huán)挑取一環(huán)使用NA平板活化培養(yǎng)24 h的菌株ML-3，并將其接種于裝有100 mL的NB培養(yǎng)液的300 mL三角瓶中，于30℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，獲得種子發(fā)酵液。

1.2.3.2 碳源優(yōu)化 以NB為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別用1%的可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、玉米粉、馬鈴薯作為碳源制備新培養(yǎng)液，滅菌后按1%的接種量，將已制備的ML-3種子液接種于不同碳源培養(yǎng)液中，于30℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，重復(fù)3次。以NB培養(yǎng)液為對照，分別采用比濁法［28］和瓊脂擴散法［27］對菌體生長量和抗菌蛋白抑菌活性進行測定。

1.2.3.3 氮源優(yōu)化 以篩選出的較優(yōu)碳源作為碳源，固定無機鹽，分別用1.5%的硫酸銨、尿素、酵母浸粉、蛋白胨、花生粉和黃豆粉作為氮源制備新培養(yǎng)液，同樣按1%的接種量，將菌株ML-3種子液接種于不同氮源培養(yǎng)液中，于30℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，3次重復(fù)。以NB培養(yǎng)液為對照，發(fā)酵中止后測定經(jīng)各培養(yǎng)液培養(yǎng)后的菌體生長量和抗菌蛋白抑菌活性。測定方法同1.2.3.2。

1.2.3.4 無機鹽優(yōu)化 以篩選出的較優(yōu)碳源和氮源作為碳、氮源，分別用0.02% CuSO4·5H2O、0.05% MgSO4、0.1% KH2PO4、0.5% NaCl、0.02%ZnSO4·7H2O和0.02% FeSO4·7H2O作為無機鹽制備新培養(yǎng)液，同樣按1%的接種量，將菌株ML-3種子液接種于不同氮源培養(yǎng)液中，于30℃，160 r/min下震蕩培養(yǎng)72 h，3次重復(fù)。以NB培養(yǎng)液為對照，發(fā)酵中止后測定菌體生長量和抗菌蛋白抑菌活性。測定方法同1.2.3.2。

1.2.3.5 發(fā)酵液配方正交優(yōu)化 采用正交試驗對單因素試驗篩選出的較優(yōu)碳源（馬鈴薯）、氮源（蛋白胨）和無機鹽（NaCl）的用量組合進行三因素三水平正交試驗，篩選出較優(yōu)配方（表1）。以抗菌蛋白抑菌活性為評價指標，測定方法同1.2.3.2。

表1 發(fā)酵液配方正交試驗因素和水平

1.2.4 發(fā)酵條件正交優(yōu)化 采用正交試驗L16（45）（表2）對菌株ML-3的發(fā)酵溫度、pH、裝液量和接種量進行優(yōu)化。使用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值，試驗重復(fù)3次，發(fā)酵結(jié)束后測定抗菌蛋白抑菌活性。測定方法同碳源優(yōu)化。

1.2.5 菌株ML-3抗菌蛋白抑菌穩(wěn)定性測定 參照采俊香等［29］文獻中描述的方法對菌株ML-3抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性進行測定。

1.2.6 菌株ML-3抗菌蛋白的馬鈴薯早疫病田間防效

1.2.6.1 藥前準備 稱取菌株ML-3抗菌蛋白干粉用水稀釋后（藥液濃度分別為：1 g/L、0.1 g/L、10mg/L和1 mg/L）于五臺縣茹村田間發(fā)病地塊（馬鈴薯開花期）采用葉面噴施進行防效測定，以清水和80%代森鋅可濕性粉劑作為對照。每處理重復(fù)3次，田間試驗安排采用隨機區(qū)組設(shè)計，各小區(qū)試驗安排見圖1。

表2 發(fā)酵條件正交試驗因素和水平

圖1 不同濃度抗菌蛋白馬鈴薯早疫病田間防效小區(qū)排列圖

1.2.6.2 田間試驗 （1）每處理隨機選擇6株植株進行藥前病情指數(shù)調(diào)查，分級標準參照農(nóng)藥田間藥效試驗準則GB/T 17980.28-2000；（2）于2019年7月18日首次噴藥，隨后每隔5 d用藥1次，連續(xù)用藥3次，并于最后一次用藥后10 d統(tǒng)計藥后病情指數(shù)，統(tǒng)計方法同藥前；（3）病情指數(shù)和田間防效計算方法與趙新貝等［30］所述方法相同。

2 結(jié)果

2.1 拮抗細菌ML-3抗菌蛋白最佳硫酸銨鹽析濃度

使用不同飽和度硫酸銨對菌株ML-3發(fā)酵液中的蛋白進行分級沉淀，并以馬鈴薯早疫病菌為靶標對各級沉淀蛋白的抑菌活性進行測定后發(fā)現(xiàn)，各級沉淀蛋白僅在硫酸銨質(zhì)量濃度為60%-80%表現(xiàn)出較強抑菌活性，該級沉淀蛋白的抑菌帶直徑為14.5 mm，同對照粗提液抑菌活性（抑菌帶為15.5 mm）相比差異較?。▓D2）；當硫酸銨質(zhì)量低于60%或高于80%所形成的蛋白沉淀均無抑菌活性；另外，對硫酸銨沉淀殘留液抑菌活性進行檢測后發(fā)現(xiàn)，其殘留液無抑菌活性，再次說明菌株ML-3抗菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)，且說明在硫酸銨飽和度為60%-80%可使菌株ML-3產(chǎn)生的抗菌蛋白完全沉淀，為該菌株抗菌蛋白提取的最佳硫酸銨飽和度（圖2）。

圖2 不同硫酸銨質(zhì)量濃度下沉淀蛋白對馬鈴薯早疫病菌抑菌活性測定

2.2 拮抗細菌ML-3胞外產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵液配方優(yōu)化

圖3 不同碳源對菌株ML-3生長和抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響

2.2.1 碳源優(yōu)化 對菌株ML-3產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵液配方中的碳源進行單因素優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，在抑菌效果方面，6種碳源中以馬鈴薯和葡萄糖效果較好，顯著高于對照，且同對照NB發(fā)酵液相比，抑菌帶直徑分別增加了8.8 mm和7.8 mm；可溶性淀粉提高效果不明顯，同對照相比差異不顯著；添加蔗糖、玉米粉和甘露醇后抑菌活性反而出現(xiàn)一定程度下降（圖3）。在菌株生長方面，6種碳源同樣表現(xiàn)出不同效果，添加葡萄糖和馬鈴薯對菌株生長量無明顯影響，同對照相比差異不顯著，但添加其他碳源后菌株ML-3的生長則出現(xiàn)不同程度抑制。說明不同碳源對菌株ML-3抗菌蛋白生物合成存在不同程度影響。綜合考慮成本、菌株生長量和抗菌蛋白抑菌活性后，選擇低成本馬鈴薯作為菌株ML-3產(chǎn)抗菌蛋白較優(yōu)碳源。

2.2.2 氮源優(yōu)化 對NB發(fā)酵液中的氮源（牛肉浸膏+蛋白胨）使用其他氮源替換后發(fā)現(xiàn)：在碳源馬鈴薯介導(dǎo)下，單獨添加氮源蛋白胨便可有效促進菌株ML-3抗菌蛋白產(chǎn)生，其抗菌蛋白抑菌帶直徑（24.2mm）顯著高于對照（15.8 mm）；使用其他無機或有機氮源替換NB中的氮源后抗菌蛋白抑菌活性則出現(xiàn)不同程度下降，其中以無機氮活性下降作為明顯（圖4）。在菌株生長量方面，單獨添加有機氮源（蛋白胨、花生粉、黃豆粉和酵母浸粉）時對菌株ML-3生長無明顯影響，但單獨無機添加氮源（尿素和硫酸銨）時則對菌株ML-3生長表現(xiàn)出明顯抑制，其OD600吸光值分別為0.509（尿素）和0.727（硫酸銨）（圖3）。因此，在馬鈴薯介導(dǎo)下選擇蛋白胨作為其較優(yōu)氮源，同對照配方相比可提高菌株ML-3抗菌蛋白抑菌活性，而且可有效降低發(fā)酵成本。

圖4 不同氮源對菌株ML-3生長和抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響

2.2.3 無機鹽優(yōu)化 無機鹽優(yōu)化結(jié)果（圖5）表明：雖然同對照相比無機鹽0.5%NaCl、0.1%KH2PO、0.02% ZnSO4·7H2O 和 0.02% FeSO4·7H2O對菌株ML-3生長無明顯影響，但在抑菌活性方面，則僅以0.5%NaCl為無機鹽時菌株ML-3抗菌蛋白抑菌活性明顯高于其他無機鹽；菌株ML-3抑菌活性對K+、Fe2+和Zn2+穩(wěn)定，而Cu2+和Mg2+則對菌株抑菌活性具有明顯抑制作用。因此選擇0.5%NaCl為較優(yōu)無機鹽。

2.2.4 正交優(yōu)化 通過單因素試驗明確馬鈴薯、蛋白胨和NaCl為菌株ML-3的最佳碳源、氮源和無機鹽后，進一步使用正交試驗對其進行了三因素三水平正交試驗，正交試驗結(jié)果（表3）顯示：組合A2B1C2、A2B2C3、A1B3C3、A2B3C1、A3B2C1 以及A3B3C2之間抑菌活性差異不顯著，說明單純依靠各處理結(jié)果很難直接判斷出哪個組合為最優(yōu)組合，需進一步通過極差、方差以及因素間互作分析。

方差、極差和因素間互作分析結(jié)果（表4）顯示：馬鈴薯、蛋白胨和氯化鈉的F值均達極顯著水平，可見該假設(shè)檢驗靈敏度高；從極差比較可以看出，碳源極差R值最大，是影響菌株ML-3抗菌蛋白產(chǎn)量的關(guān)鍵因子，其次為蛋白胨和NaCl（表3）。從因素各水平間差異顯著性分析結(jié)果可以看出，菌株ML-3產(chǎn)抗菌蛋白的較優(yōu)配方組合為A2B2C2（表5），且對該水平進行試驗驗證后發(fā)現(xiàn)在該配方下菌株ML-3抑菌帶直徑可達25.3 mm，明顯高于對照，說明該配方為菌株ML-3產(chǎn)抗菌蛋白較優(yōu)培養(yǎng)液制備配方。

圖5 不同無機鹽對菌株ML-3生長和抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響

表3 發(fā)酵液配方正交試驗結(jié)果

表4 三因素三水平方差分析

表5 試驗因素各水平間差異顯著性檢驗

2.3 拮抗細菌ML-3胞外產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵條件正交優(yōu)化

對菌株ML-3發(fā)酵條件進行正交試驗后發(fā)現(xiàn)16個組合處理中以組合A2B3C4D1E2效果最好，其抑菌帶直徑為22.3 mm明顯高于其他處理（表6）。對試驗結(jié)果進行方差、極差和因素間互作分析后發(fā)現(xiàn)5各因素的F值均表現(xiàn)出差異極顯著，說明該假設(shè)檢驗靈敏度高（表7）；從極差比較可以看出，初始pH和溫度極差R最大，說明初始pH和溫度是影響菌株ML-3抗菌蛋白產(chǎn)量的關(guān)鍵因子，其次為發(fā)酵時間、裝液量和接種量（表6）。從因素各水平間差異顯著性分析結(jié)果可以看出，菌株ML-3產(chǎn)抗菌蛋白的較優(yōu)配方組合為A2B3C4D4E2（表8），且對該水平進行試驗驗證后發(fā)現(xiàn)在該發(fā)酵條件下菌株ML-3抑菌帶直徑可達24.2 mm，明顯高于對照，說明該條件為菌株ML-3產(chǎn)抗菌蛋白較優(yōu)發(fā)酵條件。

2.4 抗菌蛋白穩(wěn)定性測定

對菌株ML-3抗菌蛋白的熱、酸堿和紫外穩(wěn)定性進行分析后發(fā)現(xiàn)：菌株ML-3抗菌蛋白在25℃-60℃之間具有良好熱穩(wěn)定性，可使抑菌帶直徑保持在20 mm以上（圖6-A）；在pH范圍5-8之間具有較好抑菌效果（圖6-B）；在紫外照射8 h內(nèi)抗菌蛋白抑菌活性下降不明顯，紫外照射36 h抑菌帶直徑仍可達19.2 mm（圖6-C），說明菌株ML-3產(chǎn)生的抗菌蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和紫外穩(wěn)定性，有制成制劑應(yīng)用于馬鈴薯早疫病生物防治的潛力。

表6 發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

表7 三因素三水平方差分析

表8 試驗處理因素各水平間差異顯著性檢驗

2.5 拮抗細菌ML-3胞外抗菌蛋白對馬鈴薯早疫病的田間防效

對菌株ML-3抗菌蛋白馬鈴薯早疫病田間防效進行測定后發(fā)現(xiàn)：該菌株抗菌蛋白濃度為1 g/L和0.1 g/L時對馬鈴薯早疫病仍可保持較好防效，防效分別為76.56%和75.83%，同對照藥劑相比防治效果差異顯著（表9）；當抗菌蛋白濃度為10 mg/L時田間防效出現(xiàn)一定程度下降，明顯低于對照藥劑，但仍可保持在70%左右；當抗菌蛋白濃度為1 mg/L時，防效下降幅度明顯，僅有23.55%。說明該菌株抗菌蛋白在馬鈴薯早疫病生物防治方面具有較好應(yīng)用潛力，且藥液抗菌蛋白有效成分含量不低于10 mg/L。

圖6 不同溫度、pH值和紫外照射時間對菌株ML-3抗菌蛋白抑菌特性的影響

表9 菌株ML-3抗菌蛋白不同稀釋倍數(shù)下的馬鈴薯早疫病田間防效

2.6 基于16S rRNA序列分析的拮抗細菌ML-3分類地位

菌株ML-3 16S rDNA序列經(jīng)27F/1492R引物擴增和測序后獲得該基因序列，長度為1 415 bp，NCBI數(shù)據(jù)庫序列登錄號MN539138。

基于菌株ML-3 16S rDNA序列使用Ezbiloud在線軟件同數(shù)據(jù)庫中的模式菌株16S rDNA序列進行比對后發(fā)現(xiàn)菌株ML-3同Bacillus tequilensisKCTC 13622T、Bacillus subtilissubsp.inaquosorumKCTC 13429T和Bacillus subtilissubsp.subtilisNCIB 3610T具有較高序列同源性，相似比分別為99.79%、99.79%和99.72%；使用MEGA 5.0基于菌株ML-3 16S rDNA和序列相似比大于96%的近緣模式菌株16S rDNA序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)菌株ML-3同模式菌株Bacillus subtilissubsp.inaquosorumKCTC 13429T聚在同一支（圖7），說明菌株ML-3同該模式菌具有較高同源性，因此通過16S rDNA序列分析可將菌株ML-3鑒定為Bacillus subtilissubsp.inaquosorum。

3 討論

抗病微生物及其天然產(chǎn)物作為植物病害生物防治藥劑的一類重要開發(fā)源，對植物病害生物防治和我國化學(xué)農(nóng)藥減量使用具有重要意義，因此近年來成為植物病害防治的一個研究熱點，且研究者已從多種來源分離和篩選出來了對植物病害具有拮抗作用的微生物［31］。然而，這些活性菌株篩選多數(shù)是以室內(nèi)平板測定來完成，只有少量菌株經(jīng)過田間試驗驗證，且目前有研究發(fā)現(xiàn)部分菌株雖然在室內(nèi)具有良好活性，但其田間活性出現(xiàn)一定程度下降或喪失，而田間具有良好活性又是抗病微生物制劑化加工和走向市場的關(guān)鍵因素［32］。另外，雖然目前我國有關(guān)馬鈴薯早疫病拮抗微生物篩選也已有相關(guān)報道，但報道數(shù)量極少，僅有楊繼業(yè)等［14］和楊登路等［15］做了相關(guān)報道，且相關(guān)研究都僅測定了拮抗菌株的室內(nèi)抑菌活性，因此，基于上述現(xiàn)狀，在篩選到馬鈴薯早疫病拮抗細菌菌株ML-3，并明確其抗菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)后本研究從生產(chǎn)實際出發(fā)，重點對該菌株的抗菌蛋白硫酸銨沉淀飽和度、發(fā)酵液配方、發(fā)酵條件、抗菌蛋白穩(wěn)定性以及田間防效進行了研究，旨在明確該菌株抗菌蛋白的制劑化加工和田間應(yīng)用潛力，為馬鈴薯早疫病生物防治藥劑開發(fā)提供新開發(fā)源。

圖7 基于菌株ML-3 16S rDNA序列分析的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

通過研究發(fā)現(xiàn)菌株ML-3抗菌蛋白的最佳硫酸銨沉淀飽和度為80%，且該菌株產(chǎn)生的抗菌蛋白在溫度低于60℃、pH值5-8以及紫外照射36 h等條件下均可保持良好抑菌活性。另外研究還發(fā)現(xiàn)菌株ML-3抑菌活性對K+、Fe2+和Zn2+穩(wěn)定，而Cu2+和Mg2+則對菌株抑菌活性具有明顯抑制作用。研究結(jié)果同枯草芽孢桿菌 Zl-2［33］、地衣芽孢桿菌 W10［34］、解淀粉芽孢桿菌HRH317［35］等菌株存在一定異同，說明不同菌株可產(chǎn)生不同抗菌蛋白，且不同抗菌蛋白的抑菌穩(wěn)定性存在一定差異。

在明確菌株ML-3抗菌蛋白穩(wěn)定性和最佳硫酸銨沉淀飽和度后，本研究還采用單因素和正交試驗對影響其產(chǎn)量的培養(yǎng)液配方和發(fā)酵條件進行了探究，結(jié)果表明：馬鈴薯作碳源可有效提高菌株ML-3抗菌蛋白產(chǎn)量，使其抑菌帶直徑比對照增加了8.8 mm；在馬鈴薯介導(dǎo)下以蛋白胨作氮源時抑菌帶直徑可達24.2 mm，明顯高于對照和其它氮源；正交試驗優(yōu)化后培養(yǎng)液配方為2%馬鈴薯、1%蛋白胨和0.5%NaCl，且在該配方下的較優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH值7.0、發(fā)酵溫度30℃、500 mL三角瓶裝液量400 mL、接種量5 mL、發(fā)酵時間48 h。該菌株產(chǎn)孢外抗菌蛋白培養(yǎng)液配方和發(fā)酵條件同枯草芽孢桿菌SH7［36］、枯草芽孢桿菌 G8［37］和枯草芽孢桿菌 B29［38］存在一定差異，造成這種差異的原因可能與菌株自身差異及來源不同關(guān)系密切，說明同種不同來源菌株在抗菌物質(zhì)產(chǎn)生方面也存在一定差異。

隨后為進一步確定該菌株抗菌蛋白的田間應(yīng)用潛力，本研究以80%代森鋅可濕性粉劑為對照藥劑，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，對不同稀釋倍數(shù)后的菌株ML-3抗菌蛋白田間防效進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株抗菌蛋白對馬鈴薯早疫病具有良好防效，且用藥濃度不低于10 mg/L時防效可達70%。另外，選擇藥前病情指數(shù)相近報道中的化學(xué)藥劑馬鈴薯早疫病防效同菌株ML-3抗菌蛋白防效進行對比后，發(fā)現(xiàn)該菌株抗菌蛋白田間防效同報道中的25%嘧菌酯懸浮劑［16］、42.4%唑醚·氟酰胺懸浮劑［39］和50%多菌靈可濕性粉劑［40］等多種化學(xué)藥劑防效相近，說明該菌株抗菌蛋白在制劑化加工和田間應(yīng)用方面具有良好潛力。

最后，雖然本研究對菌株ML-3胞外抗菌蛋白的穩(wěn)定性、發(fā)酵液配方、發(fā)酵條件、田間防效以及分類地位進行了探究，為該菌株后期大規(guī)模發(fā)酵、制劑化加工以及田間應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但有關(guān)該菌株抗菌蛋白的種類鑒定、制劑加工、制劑劑型以及多點、多年田間藥效試驗還需進一步加強研究，旨在為馬鈴薯早疫病生物防治提供新型綠色藥劑。

4 結(jié)論

生防細菌ML-3產(chǎn)抗菌蛋白的較優(yōu)培養(yǎng)液組成成分為2%馬鈴薯、1%蛋白胨和0.5%NaCl；較優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH值7.0、溫度30℃、裝液量400 mL/500 mL、接種量5 mL和發(fā)酵48 h。菌株ML-3抗菌蛋白不僅在溫度≤60℃、pH值5-8和紫外照射36 h內(nèi)具有良好穩(wěn)定性，而且對K+、Fe2+、Zn2+、Na+穩(wěn)定性較好。該抗菌蛋白的馬鈴薯早疫病田間防治用藥濃度為≥10 mg/L。