稻田土壤固氮菌株的分離篩選及促生潛力

靳海洋 王慧 張燕輝 胡天龍 林志斌 劉本娟藺興武 謝祖彬

（1. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不斷從土壤中帶走大量氮素，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的維持和提高需要穩(wěn)定的氮素來源。最初，人類主要通過種植大豆和水稻來增加土壤氮素，隨后通過開采硝酸鹽礦作為肥料和施加有機(jī)肥獲得更多的作物產(chǎn)量［1］。從通過Haber-Bosch法實(shí)現(xiàn)氮?dú)夤I(yè)化生產(chǎn)氨開始，人類打破了氮素對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的限制，化學(xué)氮肥的生產(chǎn)和應(yīng)用滿足了農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)對(duì)活性氮的需求，為不斷增長的人口提供了食物［2-3］。然而，對(duì)化學(xué)氮肥的過度依賴不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［4］。隨著化學(xué)氮肥生產(chǎn)和施用量的增加，氮肥利用率越來越低，氣態(tài)和溶解態(tài)的氮流失導(dǎo)致了水和空氣污染的增加、大氣溫室氣體濃度的升高和生物多樣性的喪失等一系列環(huán)境問題［2，5-7］。雖然人們正在努力嘗試通過各種途徑提高農(nóng)田氮肥利用率（施肥策略、種植制度、育種等）［8-12］，但過量施肥條件下的大量氮損失是不可避免的，適當(dāng)降低氮肥施用量是最根本的解決辦法。

生物固氮是固氮微生物在固氮酶的催化下將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成活性氮的自然過程，是陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)中活性氮的主要非人為輸入來源［2，13］。在廣泛應(yīng)用氮肥之前，生物固氮是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中活性氮輸入的主要來源［14］。隨著氮肥施用量的增加，人們對(duì)生物固氮的重視程度逐漸降低，然而，更有效地開發(fā)和利用自然過程生物固氮作用是逐步降低氮肥施用量的潛在途徑［15-16］。非共生固氮是非豆科作物栽培過程中的主要生物固氮途徑，在農(nóng)田氮供應(yīng)中發(fā)揮著廣泛的作用［17-18］。據(jù)估算，非共生生物固氮提供了作物氮素總量24%的氮素來源［19］。接種非共生固氮菌是提高土壤生物固氮能力，從而降低氮肥施用量的最可行方案之一［20-21］。前人研究表明，從預(yù)期發(fā)揮功能的環(huán)境中分離出的菌株可能更能適應(yīng)原位生態(tài)脅迫［22-23］。因此，為了擴(kuò)大成功接種固氮菌的可能性，有必要在各種生態(tài)條件下篩選豐富的高效固氮菌株［23］。

水稻土在我國分布范圍廣，性質(zhì)差別大，是微生物菌株分離的重要來源。研究表明紫色土水稻土、下位砂姜土水稻土和紅壤水稻土的固氮效率存在很大差異［24］。本研究選取紫色土水稻土、下位砂姜土水稻土和紅壤水稻土3個(gè)典型水稻土樣品和1個(gè)長期未施肥的紅壤水稻土樣品，嘗試從中分離固氮微生物菌株，進(jìn)而篩選優(yōu)勢(shì)固氮菌株，以期豐富微生物菌種資源，為進(jìn)一步稻田生物固氮的微生物調(diào)控研究和應(yīng)用提供菌株材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 供試土壤選取3種不同固氮效率水平的水稻土樣品［24］：紫色土水稻土（固氮效率高，42 d生物固氮量20.1 kg N /hm2，四川省鹽亭縣，中國科學(xué)院鹽亭紫色土農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站）、下位砂姜土水稻土（固氮效率中等，42 d生物固氮量9.4kg N /hm2，江蘇省揚(yáng)州市，中國FACE試驗(yàn)站）、紅壤水稻土（固氮效率低，42 d生物固氮量2.2 kg N/hm2，江西省鷹潭市，中國科學(xué)院鷹潭紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站），另選取一個(gè)低肥力水平土壤樣品：來自中國科學(xué)院鷹潭紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站長期定位試驗(yàn)未施肥小區(qū)的紅壤水稻土（江西省鷹潭市），共4個(gè)水稻土樣品。土壤樣品于2014年4-5月采自田間耕作層（0-15 cm），隨后進(jìn)行風(fēng)干過2 mm篩，室溫保存。2018年4月，將土壤樣品淹水1-2 cm，28℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)14 d，以恢復(fù)土壤微生物活性，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行菌株分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 固氮微生物的分離與培養(yǎng)選用Brown無氮培養(yǎng)基［25-27］：葡萄糖5 g/L，無水CaCl20.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04g/L，Na2MoO40.005 g/L，K2HPO40.8 g/L。pH為6.8-7.0。固體培養(yǎng)基另加瓊脂糖10-15 g/L。FeSO4·7H2O單獨(dú)過濾滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。葡萄糖單獨(dú)過濾滅菌。K2HPO4與金屬鹽分開滅菌。

1.2 方法

1.2.1 平板稀釋法分離固氮微生物 取土壤10 g于250 mL無菌三角瓶中，加入無菌水至100 mL體積，28℃、180 r/min振搖30 min，然后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）。吸取 100 μL稀釋液平板涂布法均勻接種到固體Brown無氮培養(yǎng)基上，倒置于28℃恒溫黑暗培養(yǎng)5-7 d［28］。選擇菌落數(shù)在20-200之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算無氮培養(yǎng)基上可培養(yǎng)微生物數(shù)量密度［18，29］。根據(jù)菌落形態(tài)選擇長勢(shì)較好、生長速度較快的不同菌落，用接種環(huán)平板劃線法接種于新的固體無氮培養(yǎng)基上單獨(dú)純化培養(yǎng)。

1.2.2 富集純化法分離固氮微生物 取土壤10 g于250 mL無菌三角瓶中，加入液體Brown無氮培養(yǎng)基至100 mL體積，28℃、180 r/min振搖富集培養(yǎng)4-5 d，然后1%轉(zhuǎn)接到新的液體無氮培養(yǎng)基中進(jìn)一步振搖富集培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)接3-4次后得到在液體無氮培養(yǎng)基中生長較快的以固氮微生物為優(yōu)勢(shì)菌群的菌液，然后進(jìn)行稀釋涂板挑選純化。

1.2.3 菌株的16S rRNA基因鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0）（TaKaRa，Code No.9763）提取菌株基因組DNA。用NanoDrop 1000（Thermo Scientific）進(jìn)行DNA樣品的定量和純度檢測(cè)。使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)菌株基因組DNA的16S rRNA基因全長序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［25，30］。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶切割后采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（Sangon Biotech，Order NO. B518131）回收目的DNA片段。使 用 3730xl DNA Analyzer（Applied Biosystems） 進(jìn)行DNA片段的序列分析，測(cè)序試劑盒使用BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystems）。 雙 向 測(cè) 序結(jié)果使用SeqMan（DNASTAR Lasergene）進(jìn)行拼接，得到接近全長的16S rRNA基因序列。使用EzBioCloud Identify service（https：//www.ezbiocloud.net/identify）［31-33］和 NCBI Nucleotide BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將16S rRNA基因序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選擇有效命名的模式菌株作為參考。

1.2.4 菌株基因組DNA的nifH基因擴(kuò)增 采用引物Pol-F（5'-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3'）、Pol-R（5'-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3'）［34］對(duì)菌株基因組DNA的nifH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陰性對(duì)照使用ddH2O和大腸桿菌基因組DNA作為模板。

1.2.5 乙炔還原活性測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長中期（OD600=0.4-0.8）的菌液加入125 mL玻璃瓶中，密封后用注射器將瓶內(nèi)氣體體積的10%空氣置換為純化的高純乙炔［13，35-36］。繼續(xù)培養(yǎng)2-24 h后收集瓶內(nèi)氣體，用帶有氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）的氣相色譜儀（Shimadzu，GC-2014C）分析乙烯濃度［37-38］。采用Bradford法［39］測(cè)定菌液的蛋白量來表征其生物量，計(jì)算單位時(shí)間單位質(zhì)量蛋白的乙烯生成速率（nmol C2H4/（mg·min））。以固氮菌屬（Azotobacter）模式菌株A. chroococcumATCC 9043T作為參比菌株。

1.2.6 菌株在無氮培養(yǎng)基中的生長曲線測(cè)定 以液體Brown無氮培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長中期菌液（OD600≈0.6）作為種子液，1%接種于裝有100mL液體Brown無氮培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，透氣封口膜封口，于28℃、180 r/min振搖培養(yǎng)，每2 h取樣測(cè)定OD600，繪制菌株在無氮培養(yǎng)基中的生長曲線。

1.2.7 菌株的IAA生成測(cè)定 將菌株種子液（OD600≈0.6）1%接種于含有500 mg/L L-色氨酸的液體Brown無氮培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振搖培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌液中的IAA含量。將菌液離心（10 000×g，10 min），取上清液加入等體積顯色液（10.8 mol/L H2SO4、4.5 g/L FeCl3），混勻避光靜置30 min，測(cè)定其OD540。用0.5-20 μg/mL IAA標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液IAA含量［40］。

1.2.8 菌株的溶磷活性測(cè)定 將菌株種子液1%接種于以磷酸三鈣作為難溶磷酸鹽的液體NBRIP培養(yǎng)基［41］中，28℃、180 r/min振搖培養(yǎng)7 d。將菌液離心（10 000 ×g，10 min），取上清液用鉬藍(lán)比色法測(cè)定菌液中可溶性磷含量的變化［42-43］。

1.2.9 菌株的鐵載體生成測(cè)定 將菌株培養(yǎng)在液體Brown無氮培養(yǎng)基（去鐵）中，28℃、180 r/min振搖培養(yǎng)72 h，測(cè)定菌液中的鐵載體。將菌液離心（10 000×g，10 min），取上清液加入等體積CAS檢測(cè)液，混勻靜置1 h。以蒸餾水為空白測(cè)定OD630，未接菌培養(yǎng)基作為參比對(duì)照，鐵載體活性單位=［（對(duì)照吸光度-樣品吸光度）/對(duì)照吸光度］［44］。

2 結(jié)果

2.1 不同土壤樣品在無氮培養(yǎng)基上的可培養(yǎng)微生物數(shù)量

通過稀釋平板法在Brown無氮培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d測(cè)得的可培養(yǎng)微生物數(shù)量如圖1所示，紫色土水稻土在無氮培養(yǎng)基上的可培養(yǎng)微生物數(shù)量最多，其次為下位砂姜土水稻土、紅壤水稻土。無氮培養(yǎng)基上可培養(yǎng)微生物數(shù)量的多少與土壤固氮效率的高低規(guī)律表現(xiàn)一致。紅壤低肥力水稻土樣品中在無氮培養(yǎng)基上的可培養(yǎng)微生物數(shù)量最少，約為紫色土水稻土的1/10。

圖1 無氮培養(yǎng)基上可培養(yǎng)微生物數(shù)量

2.2 不同土壤樣品在無氮培養(yǎng)基中的富集效果

4種土壤樣品在Brown無氮培養(yǎng)基中的富集效果不同。在轉(zhuǎn)接富集過程中，下位砂姜土水稻土、紅壤水稻土、紅壤低肥力水稻土富集液中微生物生長逐漸減緩，在進(jìn)行3次轉(zhuǎn)接富集后，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)依然不可見明顯的微生物增殖跡象（圖2）。紫色土水稻土富集液在無氮培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接富集效果較好，1%接種量轉(zhuǎn)接5次后能夠持續(xù)保持24 h內(nèi)富集液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)。對(duì)紫色土水稻土富集所得混合菌液進(jìn)行梯度稀釋涂布分離，平板上的菌落形態(tài)較為一致，通過劃線純化，混合菌液中僅得到1株菌株（P208）。

圖2 不同土壤樣品在無氮培養(yǎng)基中的富集效果

表1 分離純化所得菌株列表

2.3 新分離菌株的16S rRNA基因鑒定

采用平板稀釋法從4種水稻土樣品中分離得到13株能夠在固體Brown無氮培養(yǎng)基上較快生長的菌株，從劃線接種到長出穩(wěn)定的單菌落約需2-5 d，加上紫色土水稻土富集液中得到的菌株P(guān)208，共得到14株菌株（表1）。通過菌株16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合重建的系統(tǒng)發(fā)育樹信息，14株新分離菌株分別可歸類為：假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）1株、芽孢桿菌屬（Bacillus）3株、固氮菌屬（Azotobacter）4株、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）2株、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）1株、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）2株、根瘤菌屬（Rhizobium）1株。

2.4 新分離菌株的nifH基因擴(kuò)增

通過檢測(cè)新分離菌株基因組DNA的nifH基因可以明確其是否具有固氮潛力。結(jié)果（圖3）表明，菌 株 P204、P205、P207、P208、B205、HR203和LR204共計(jì)7個(gè)菌株的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后在250-500 bp之間均出現(xiàn)明亮條帶，而其余新分離菌株、陰性對(duì)照Escherichia coli與ddH2O無明顯條帶，經(jīng)多次nifH基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果一致，即在固體無氮培養(yǎng)基上生長的14株菌株中有7株菌株擴(kuò)增出nifH基因，占新分離菌株的50%。

圖3 新分離菌株的nifH基因PCR擴(kuò)增

2.5 新分離菌株的乙炔還原活性

采用乙炔還原法（ARA）測(cè)定菌液的乙炔還原活性是定量表征菌株固氮能力的重要方法［37-38，45-47］。在液體Brown無氮培養(yǎng)基中，菌株P(guān)204、P205、P207和P208的乙炔還原活性較高，對(duì)數(shù)生長中期菌液在10%乙炔中培養(yǎng)2 h即可檢測(cè)到適宜計(jì)算的乙烯峰，其他10株菌株在10%乙炔中培養(yǎng)24 h后檢測(cè)到的乙烯峰較低或未檢測(cè)到乙烯峰。對(duì)數(shù)生長中期菌液在10%乙炔中培養(yǎng)2 h的測(cè)定結(jié)果如圖4所示，菌株P(guān)208的乙炔還原活性最高，顯著高于參比菌株ATCC 9043。

2.6 新分離菌株在無氮培養(yǎng)基中的生長速率

分離純化得到的14株菌株中，菌株P(guān)204、P205、P207和P208生長較快，在28℃條件下劃線培養(yǎng)2 d后即可長出穩(wěn)定的單菌落，1%接種于液體無氮培養(yǎng)基后28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h內(nèi)可觀察到菌液渾濁。其他菌株（除菌株P(guān)204、P205、P207和P208外）在28℃條件下劃線培養(yǎng)通常需要5 d才可以看到明顯菌落，將這些菌株單菌落接種于液體無氮培養(yǎng)基（3 mL）中，28℃、180 r/min培養(yǎng)，難以較快（5 d內(nèi)）生長至菌液渾濁狀態(tài)。

圖4 菌株的乙炔還原活性

如圖5所示，菌株P(guān)204、P205、P207、P208和參比菌株ATCC 9043在1%接種后于28℃、180 r/min培養(yǎng)，12 h后能通過OD600檢測(cè)到明顯生長，菌株P(guān)204、P205、P207和P208在26 h后達(dá)到穩(wěn)定生長期，生長活力較強(qiáng)的時(shí)間段為12-24 h。

結(jié)合基因組DNA的nifH基因擴(kuò)增、乙炔還原活性和無氮培養(yǎng)基上的生長狀況等，確定菌株P(guān)204、P205、P207和P208為本次分離篩選工作得到的優(yōu)勢(shì)固氮菌株。

圖5 菌株在無氮培養(yǎng)基中的生長曲線

2.7 優(yōu)勢(shì)固氮菌株的促生潛力

2.7.1 IAA生成 IAA的生成能力是促進(jìn)植物生長細(xì)菌普遍具有的特征之一。如圖6所示，優(yōu)勢(shì)固氮菌株 P204、P205、P207、P208與參比菌株 ATCC 9043均具有IAA生成的能力，其中菌株P(guān)208的IAA生成能力顯著高于其他菌株。

2.7.2 溶磷活性 溶磷活性是促進(jìn)植物生長細(xì)菌的重要促生機(jī)制之一。如圖7所示，在含有難溶磷酸鹽磷酸三鈣的NBRIP培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，優(yōu)勢(shì)固氮菌株P(guān)204、P205、P207、P208和參比菌株ATCC 9043的液體培養(yǎng)液中均檢測(cè)到可溶性磷含量的增加，表明其具有一定的溶磷活性。

2.7.3 鐵載體生成 鐵載體生成測(cè)定值大于50%的菌株為能力較強(qiáng)的菌株。如圖8所示，優(yōu)勢(shì)固氮菌株P(guān)204、P205、P207、P208和參比菌株ATCC 9043均具有鐵載體生成的能力，其中P208的鐵載體生成能力顯著高于其他菌株，活性單位高達(dá)88.21%，而P205的鐵載體合成能力較弱。

圖6 菌株的IAA生成

圖7 菌株的溶磷活性

3 討論

從不同生境和樣品來源中能夠分離出不同適應(yīng)能力和功能的固氮菌株。根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康?，前人研究中選用尾礦區(qū)土壤［48-49］、作物植株［50-51］、林木和作物的根際土壤［52-53］等進(jìn)行固氮菌株的分離和篩選。本研究中，為了為稻田生物固氮能力的微生物調(diào)控提供菌種資源，選用稻田土壤作為固氮菌株的分離來源，得到的菌株大多可歸類于固氮菌屬（Azotobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）等已確定的非共生固氮微生物類群［54］。

圖8 菌株的鐵載體生成

稀釋平板法和富集純化法是采用選擇性培養(yǎng)基分離微生物的主要方法。本研究中，在較短培養(yǎng)時(shí)間（2-3 d）內(nèi)，各個(gè)稀釋度平板上大部分菌落還未明顯出現(xiàn)，但稀釋度較低（10-1-10-2）的平板上出現(xiàn)了個(gè)別較大的菌落。經(jīng)過劃線純化，從這些菌落中能夠分離出在固體無氮培養(yǎng)基上快速生長的菌株，推測(cè)這些菌株在土壤中的密度較小，采用稀釋平板法分離時(shí)容易在連續(xù)稀釋過程中遺失。富集純化法能夠?qū)⑦x擇性培養(yǎng)基中生長較快的微生物快速富集為優(yōu)勢(shì)菌群，可以避免固氮能力較強(qiáng)但土壤中密度較小的固氮菌株在稀釋平板法的稀釋過程中遺失，但得到的菌株類型較少。在微生物分離試驗(yàn)中，兩種方法的結(jié)合使用有助于得到相對(duì)全面而高效的菌株。不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件能分離出不同的微生物菌株［55-56］，本試驗(yàn)中的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件未能在紅壤水稻土等3個(gè)土壤樣品中篩選出固氮能力較強(qiáng)的菌株，更多培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下的分離篩選工作還有待進(jìn)一步進(jìn)行。

瓊脂粉是一種較為理想的固體培養(yǎng)基凝固劑，是包含瓊脂糖和瓊脂果膠等的混合物。本研究預(yù)試驗(yàn)中采用未去雜的生物級(jí)瓊脂粉作為固體無氮培養(yǎng)基凝固劑，得到的可培養(yǎng)微生物數(shù)量與后期采用瓊脂糖作為凝固劑的平板計(jì)數(shù)相比，結(jié)果顯著偏高（圖1，圖9）。因此，在固氮微生物分離過程中不能直接使用未進(jìn)行進(jìn)一步純化的瓊脂粉作為固體無氮培養(yǎng)基的凝固劑，可在使用前進(jìn)行水洗去雜（操作繁瑣），或直接采用純化程度更高的Noble級(jí)瓊脂（成本較高）［18］，瓊脂糖可作為一個(gè)較佳的選擇。

編碼固氮酶鐵蛋白亞基的nifH基因在固氮微生物中高度保守，為明確微生物的固氮潛力提供了依據(jù)［57-58］。理論上，經(jīng)過無氮培養(yǎng)基選擇性分離得到的菌株即為以N2為唯一氮源的微生物菌株，而本研究在無氮培養(yǎng)基上分離得到的14株菌株中，僅有50%的菌株能夠擴(kuò)增出nifH基因。分析可能與引物和PCR反應(yīng)程序的選擇有關(guān)，引物PolF/PolR能夠從大多數(shù)代表性固氮微生物基因組中成功擴(kuò)增出nifH基因［34］，但任何通用引物都無法全面覆蓋nifH基因的多樣性［59］，這與前人的研究相一致［18］。另一方面，分離得到的菌株也可能包含利用培養(yǎng)基中極微量氮元素和空氣中微量氨氣作為氮源生存的微生物［18］，這部分菌株在優(yōu)勢(shì)固氮菌的篩選過程中逐步被淘汰。本研究中，所有分離所得菌株同時(shí)采用乙炔還原法定量測(cè)定了固氮活性，結(jié)合固氮培養(yǎng)基上生長狀況等結(jié)果篩選優(yōu)勢(shì)固氮菌株，避免了nifH基因引物和PCR反應(yīng)程序選擇對(duì)固氮菌株篩選的影響。

本研究最終篩選得到優(yōu)勢(shì)固氮菌株P(guān)204、P205、P207和P208，4株菌株在乙炔還原活性、IAA生成、溶磷活性和鐵載體生成等方面各有不同，為同一土壤來源的不同菌株。經(jīng)過16S rRNA基因相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析，可初步鑒定屬于固氮菌屬（Azotobacter）。由于能夠產(chǎn)生胞外多糖，環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)［25］，固氮菌屬（Azotobacter）具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值。前人研究表明，除固氮作用外，固氮菌屬（Azotobacter）菌株能夠活化土壤中的無機(jī)磷、礦物鉀，提高土壤磷鉀的有效性［60-61］。陳勝男等［62］研究表明，接種固氮菌屬（Azotobacter）菌株能夠提高玉米根際土壤脲酶活性和細(xì)菌總代謝活性。Romero-Perdomo等［20］的研究結(jié)果顯示，接種固氮菌屬（Azotobacter）菌株能夠促進(jìn)棉花植株的生長，減少氮肥施用量。另外，該屬菌株還可應(yīng)用于生物表面活性劑、功能性多糖等生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)［25，63］。本試驗(yàn)中分離篩選得到的固氮菌屬（Azotobacter）菌株具有較強(qiáng)的固氮能力和促生潛力，特別是菌株P(guān)208，乙炔還原活性為模式菌株A. chroococcumATCC 9043T的2.18倍，IAA生成能力為ATCC 9043T的1.48倍，鐵載體活性單位高達(dá)88.21%，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

圖9 瓊脂粉固化的無氮培養(yǎng)基上可培養(yǎng)微生物數(shù)量

4 結(jié)論

共分離純化得到異養(yǎng)菌株14株，為土壤微生物研究和應(yīng)用提供了豐富的試驗(yàn)材料和微生物菌種資源。在新分離純化得到的菌株中，菌株P(guān)204、P205、P207和P208在無氮培養(yǎng)基上生長速率較快，乙炔還原活性較高，且具有IAA生成、溶磷活性和鐵載體生成的促生潛力，具有很好的應(yīng)用研究潛力，可用于進(jìn)一步功能基因開發(fā)和微生物接種應(yīng)用研究。