脂肪干細胞對于同種異體脂肪移植免疫排斥反應的抑制作用

高長春，張雪松，崔 磊，周晨笑，商 婷，梁順濤

1.佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154000；2.北京首都醫(yī)科大學附屬世紀壇醫(yī)院中心實驗室，北京 100000

在同種異體脂肪移植的手術(shù)當中存在著移植后出現(xiàn)大量的移植組織壞死情況，脂肪移植技術(shù)的開展已有100多年的歷史，因其手術(shù)操作方便、充盈外形好等優(yōu)點而深受整形外科醫(yī)師的重視［1］，在同種自體的脂肪移植當中雖無免疫排斥反應但在異體脂肪移植當中存在著以免疫排斥反應為主的等情況影響著脂肪移植手術(shù)后移植脂肪組織的成活率［2］。由于受體與供體之間不同的免疫系統(tǒng)，移植術(shù)后會出現(xiàn)以T細胞為主的急性免疫排斥反應與慢性排斥反應，從而引發(fā)多種T細胞與B細胞介導的細胞免疫應答以及體液免疫應答，影響著術(shù)后移植組織的成活率［3］。研究表明，脂肪干細胞可通過旁分泌的機制對免疫排斥反應產(chǎn)生抑制作用［4-9］。而在特定濃度的透明質(zhì)酸凝膠當中，脂肪干細胞將會聚集成為不易流散的球體［10-11］。本文旨在研究脂肪干細胞對于同種異體脂肪移植當中的免疫排斥反應的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

PBS（phosphate buffer saline）緩沖液（Eallbio公司，中國）、胎牛血清（Sciencell，美國）、DMEM（dulbecco's modified eaglemedium）低糖培養(yǎng)基（Eallbio公司，中國）、胰蛋白酶（Eallbio公司，中國）、Ⅰ型膠原酶（Worthington，中國）、HE（蘇木精-伊紅）染色試劑盒（雷根公司，中國）、BODIPY染色試劑盒（Invitrogen公司，美國）、脂周蛋白抗原（中杉金橋公司，中國）、免疫熒光染色封片劑（中杉金橋公司，中國）。

1.2 動物實驗分組

設30只C57BL/6J小鼠和10只BAL/BC小鼠作為實驗對象，其中10只BAL/BC小鼠作為異體脂肪移植的供體提供移植所需的脂肪組織，10只C57BL/6J小鼠作為脂肪干細胞細胞的提供者，10只C57BL/6J小鼠作為對照組，移植過程無脂肪干細胞參與，10只C57BL/6J小鼠作為實驗

組，移植過程中加入自體脂肪干細胞干預。

1.3 C57BL/6J小鼠的脂肪干細胞提取與擴增

處死6周齡大的C57BL/6J小鼠后，提取其腹股溝部的脂肪組織剪碎并加入PBS，以1 200 g離心3分鐘后加入0.1%Ⅰ型膠原酶放置于37℃，80 g搖床50分鐘，然后以2 000 g離心15分鐘，吸棄上清，將沉淀放置于培養(yǎng)皿中，加入混有胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。放入?yún)?shù)為37℃，濃度10%的CO2培養(yǎng)箱當中培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)皿當中的上清液，使用PBS緩沖液洗去殘余胎牛血清，加入1 m l胰蛋白酶消化脂肪干細胞，等待細胞懸浮后加入胎牛血清終止消化，以1 500 g離心5分鐘后，均勻分開放入多個培養(yǎng)皿當中進行擴增。

1.4 脂肪干細胞成球?qū)嶒?/h3>

經(jīng)相關(guān)資料［10-11］得知，在10%濃度的透明質(zhì)酸凝膠當中，脂肪干細胞將會獲得最佳的成球效果。所以將擴增后的C5BL/6J的1ml的2×106數(shù)量的脂肪干細胞單細胞懸液滴于1 ml的20%透明質(zhì)酸凝膠中，12小時后，得到包含1×106/ml成球脂肪干細胞的濃度為10%的透明質(zhì)酸凝膠（圖1A）。

1.5 同種異體脂肪移植手術(shù)

處死6周齡大的供體BAL/BC小鼠后，提取其腹股溝部的脂肪組織，剪碎（圖1B）。與含有成球C57BL/6J小鼠脂肪干細胞均勻混合（圖1C）。采用1m l注射器吸取移植液體備用（圖1D）。將受體C57BL/6J小鼠進行腹腔內(nèi)注射濃度為5%的水合氯醛進行麻醉，等待完全麻醉，由于小鼠的頭部皮下組織緊密，異于其他部位的皮膚于皮下組織較為寬松，不利于移植脂肪的固定栽種，所以挑選小鼠的頭部位置作為同種異體脂肪移植的預定位置，小鼠的頭皮下部位可以較為牢固的將移植脂肪固定，有利于達到取材時間點時對移植的脂肪進行取材，首先將頭部（移植部位）毛發(fā)剔除，以便于開放視野，有利于在預定位置進行移植，然后提起小鼠松弛的背頸部皮膚，使用25 m l注射器的針頭從小鼠背頸刺入，沿皮下行至頭皮部位后，按壓針頭所在的位置，防止移植脂肪組織流散，緩慢推壓注射器，將注射器內(nèi)的移植脂肪組織通過針頭注射至小鼠的頭皮下，每只小鼠的注射移植量為0.2 m l，對照組為0.2 m l純脂肪組織，實驗組為0.1 m l的脂肪組織加0.1 m l含有脂肪干細胞的透明質(zhì)酸凝膠，總計0.2 m l。注射完成后迅速抽出針頭，同時在退針部位按壓10分鐘，防止移植脂肪組織跟隨針頭出入軌跡溢出。等待至小鼠麻醉恢復后，放入籠舍，繼續(xù)按照正常標準進行飼養(yǎng)，等待取材日期。

圖1 成球ADSC的制備以及同種異體脂肪的手術(shù)示意圖

1.6 移植脂肪取材檢測

在同種異體脂肪手術(shù)3個月后將受體C57BL/6J小鼠處死，并取出頭皮下的移植脂肪作為樣本進行如下檢測：（1）HE檢測：將移植物組織塊進行石蠟包埋，切片，利用堿性的蘇木精染色將細胞核標記為藍紫色，利用酸性的伊紅染液將細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)標記為紅色。（2）BODIPY顏色：使用BODIPY493/503染色特異性的標記脂滴,BODIPY染料是一種近紅外的短波長熒光染料，特異性的作用于中性脂組成的脂滴，通過熒光顯微鏡的激發(fā)光在鏡下呈現(xiàn)出帶有綠色熒光的脂滴輪廓。（3）脂周蛋白免疫熒光染色：脂周蛋白是一類由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性內(nèi)核和由蛋白質(zhì)、磷脂、膽固醇等組成的外殼構(gòu)成的球狀微粒，在脂肪細胞的正常代謝過程當中起重要作用，借此可以將脂周蛋白作為活性脂肪細胞的特異性標記，使其作為免疫熒光染色的特異性抗原被標記，而后使用熒光顯微鏡觀察移植物當中脂周蛋白的表達情況，同時也代表著移植脂肪細胞的存活情況。

1.7 統(tǒng)計學方法

運用Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正太分布資料采用Mann-WhitneyY檢驗，多組數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析和LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在手術(shù)完成結(jié)束后，有7只對照組小鼠的頭皮下移植脂肪流散被消化吸收無法取材，有5只實驗組小鼠的頭皮下移植脂肪被消化吸收無法取材。將采取如下改進措施：在完成頭皮下注射移植脂肪后，使用外科縫合的方式對移植部位（頭皮下）進行縫合固定，防止移植脂肪與HA凝膠所組成的流體在皮下流散難以取材。

手術(shù)完成3個月后，分別將實驗組和對照組的小鼠進行處死，取材。然后將取出移植脂肪進行HE染色，BODIPY染色以及脂周蛋白免疫熒光檢測，見圖2。

圖2 有無ADSC參與的移植脂肪檢測結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察脂周蛋白免疫熒光切片，每只小鼠進行3次于10×10鏡下視野中計數(shù)成活脂肪細胞個數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果，見圖3。

圖3 脂肪細胞計數(shù)結(jié)果統(tǒng)計

根據(jù)結(jié)果顯示，有脂肪干細胞參與的同種異體脂肪移植實驗的術(shù)后脂肪存活率高于沒有脂肪干細胞參與的同種異體脂肪移植實驗的術(shù)后脂肪存活率，說明脂肪干細胞對于同種異體脂肪移植排斥反應有一定的抑制作用。

3 討論

現(xiàn)有研究結(jié)果已經(jīng)表明自體脂肪移植手術(shù)的可行性，而在異體脂肪移植手術(shù)當中存在著各種免疫排斥反應，本

文已初步探索ADSC對于異體脂肪移植手術(shù)當中免疫排斥的抑制作用，或可通過這種抑制效果來提升術(shù)后移植脂肪的存活率［12-14］。然而對于異體脂肪移植后脂肪細胞的存活率提高具體可達到何種效果，還有待于進一步研究實驗的進行。

在異體脂肪移植手術(shù)中以及移植術(shù)后的恢復階段，會發(fā)生總計三種不同類型的免疫排斥反應，其發(fā)生的機制也各不相同，第一種類型是超急性免疫排斥反應，主要發(fā)生時間為移植物與宿主血管接通后的數(shù)分鐘至24小時內(nèi)，發(fā)生機制為在移植前已經(jīng)產(chǎn)生供體同種異型抗原特異性抗體，在其他方面常見于反復輸血，多次妊娠以及再次移植等情況，在本次研究當中可以忽略不計，第二種類型是急性免疫排斥反應，發(fā)生時間為移植后數(shù)天或數(shù)周，作為本次實驗的主要排斥反應，其主要發(fā)生的是細胞免疫應答。急性免疫排斥反應還分為早期急性免疫排斥反正和中期急性免疫排斥反應，其中早期急性免疫排斥反應的主要發(fā)生機制為T細胞通過直接識別的方式活化，引發(fā)以CD8+CTL為主、CD4+TH1為輔的細胞免疫應答，中期急性免疫排斥反應的主要發(fā)生機制為T細胞通過間接識別的方式活化，以CD4+TH1細胞通過釋放TH1型細胞因子介導產(chǎn)生的細胞免疫應答為主；以CD4+TH2細胞與B細胞協(xié)同作用介導產(chǎn)生的體液免疫應答為輔。第三種類型是慢性免疫排斥反應，發(fā)生時間為術(shù)后數(shù)月甚至數(shù)年，主要的病理特征為血管壁炎性細胞浸潤、間質(zhì)纖維化。引起慢性免疫排斥反應的主要因素有：（1）、T細胞和巨噬細胞等介導的遲發(fā)性超敏反應所產(chǎn)生的免疫損傷；（2）、B細胞產(chǎn)生的抗體活化補體或通過ADCC（抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用）破壞血管內(nèi)皮細胞；（3）、急性免疫排斥反應反復發(fā)作所導致的移植物退行性性變。各種不用免疫排斥反應在不同時間段當中發(fā)生，以各種方式對移植物造成的損傷導致了異體脂肪移植術(shù)的移植脂肪成活率低下，而將宿主的脂肪干細胞與移植脂肪進行混合，將會對移植脂肪的成活率有所幫助［15-18］。

然而，脂肪干細胞究竟是通過什么方式改善了同種異體脂肪移植中移植物的成活狀況［19］，究竟抑制了哪種免疫排斥反應類型當中的哪種發(fā)生機制以及脂肪干細胞在異體移植后的轉(zhuǎn)歸問題仍舊未可知也，這些問題還期待著進一步的深入探索。