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    LC-MS/MS法測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量

    2020-07-09 14:50黃翠云張鳳柳珂陳萬生楊軍
    中國藥房 2020年1期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)譜聯(lián)用腫瘤患者液相色譜

    黃翠云 張鳳 柳珂 陳萬生 楊軍

    摘 要 目的:建立測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇含量的方法。方法:采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù),以文多靈為內(nèi)標(biāo),測定腫瘤患者給予紫杉醇后惡性腹水中紫杉醇的含量,色譜柱為Zorbax SB-C18,流動相為水溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸銨)-乙腈溶液(40 ∶ 60,V/V),流速為0.25 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣量為5 μL,離子源為電噴霧離子源,檢測模式為多重反應(yīng)離子監(jiān)測正離子模式,干燥氣溫度為350 ℃,干燥氣流速為10 L/min,毛細管電壓為4 000 V,紫杉醇和內(nèi)標(biāo)在正離子模式下質(zhì)荷比(m/z)分別為876.5→308.0、457.3→188.1,碎片電壓分別為250、150 V,碰撞電壓分別為30、20 eV。結(jié)果:紫杉醇檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為25~2 500 ng/mL(r2=0.996 5,n=7);定量下限為25 ng/mL;日內(nèi)、日間精密度試驗的RSD為0.61%~3.62%(n=5、3);準(zhǔn)確度為95.34%~98.76%(n=5、3);提取回收率的RSD為3.19%~3.72%(n=3);基質(zhì)效應(yīng)的CV為1.52%~2.93%(n=3);穩(wěn)定性試驗的RE均小于3%(n=3)。結(jié)論:該方法簡便、準(zhǔn)確,可用于測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量。

    關(guān)鍵詞 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;腫瘤患者;腹水;紫杉醇;含量測定

    中圖分類號 R969 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408(2020)01-0086-05

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.15

    ABSTRACT? ?OBJECTIVE: To establish a method for content determination of paclitaxel in malignant ascites of tumor patients. METHODS: LC-MS/MS method was adopted. Using vindoline as internal standard, the content of paclitaxel in ascites of tumor patients was determined. The separation was performed on Zorbax SB-C18 column with mobile phase consisted of aqueous solution (containing 0.1% formic acid and 10 mmol/L ammonium acetate)-acetonitrile (40 ∶ 60, V/V) at the flow rate of 0.25 mL/min. the column temperature was 30 ℃, and sample size was 5 μL. The ion source was electrospray ion source, and the detection mode was multiple ion monitoring positive ion mode. MS parameters were set as following as dry gas temperature 350 ℃,dry gas flow rate 10 L/min,capillary voltage 4 000 V. Quantitative determination was operated in the multiple reaction monitoring (MRM) mode,with the ion transitions m/z 876.5→308.0 for paclitaxel and m/z 457.3→188.1 for the internal standard. The fragment voltage/collision energy for paclitaxel and the internal standard were 250 V/30 eV, and 150 V/20 eV,respectively. RESULTS: The linear range of paclitaxel were 25-2 500 ng/mL (r2=0.996 5, n=7). The lowest limit of quantitation was 25 ng/mL. RSDs of inter-day and intra-day precision tests were 0.61%-3.62%(n=5, 3). Accuracies were 95.34%-98.76%(n=5, 3). RSDs of extraction recovery were 3.19%-3.72%(n=3). CV of matrix effect were 1.52%-2.93%(n=3). RE of stability tests were lower than 3% (n=3). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate and suitable for the content determination of paclitaxel in malignant ascites of tumor patients.

    KEYWORDS? ?LC-MS/MS; Tumor patient; Malignant ascites; Paclitaxel; Content determination

    惡性腫瘤已經(jīng)成為全球較大的公共衛(wèi)生問題之一[1]。惡性腹水是由于惡性腫瘤病變引起腹腔臟壁層腹膜發(fā)生彌漫性病變而導(dǎo)致腹腔內(nèi)液體異常增多的現(xiàn)象,是惡性腫瘤晚期常見的并發(fā)癥,在40%~60%的惡性腹水中能找到脫落的惡性腫瘤細胞[2]。紫杉醇是具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物,在過去的幾十年里,紫杉醇廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的治療,以紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療是上述惡性腫瘤晚期腹水的主要治療方案[3-4]。已有研究表明,全身化療聯(lián)合腹腔灌注化療方案對于全身多器官轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者,尤其是腹膜轉(zhuǎn)移胃癌患者,能夠使抗癌藥物在腹腔內(nèi)維持較高的血藥濃度,從而抑制腫瘤細胞生長[5]。但目前尚未有相關(guān)研究開展紫杉醇惡性腹水濃度與療效之間的關(guān)系研究,而僅僅監(jiān)測紫杉醇在血漿中的濃度不能準(zhǔn)確反映其在惡性腹水中的濃度,因此,需建立穩(wěn)定、可靠的檢測方法,監(jiān)測紫杉醇在惡性腹水中的藥物濃度,為未來開展其濃度-療效相關(guān)性研究提供檢測技術(shù)。

    目前已有多種分析方法對紫杉醇進行測定,例如反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定大鼠血漿中紫杉醇的濃度[6]、RP-HPLC法或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)測定制劑中紫杉醇的含量[7-8]。但關(guān)于惡性腹水中紫杉醇含量的檢測方法目前研究較少。LC-MS/MS法是一種靈敏度高、特異性強的紫杉醇含量測定方法。因此,本課題組在前期研究[9]的基礎(chǔ)上,采用LC-MS/MS法,以文多靈為內(nèi)標(biāo),建立了測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇含量的方法,以期為臨床監(jiān)測相關(guān)患者惡性腹水中紫杉醇的有效濃度提供檢測技術(shù)。紫杉醇和文多靈化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1。

    1 材料

    1.1 儀器

    1200型HPLC-G6410A型三重四級桿MS/MS儀,包括G1311A型四元泵、G1322A型真空脫氣機、G1329A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、MassHunter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理工作站B.01.03(美國Agilent公司);BSA124S-CW型天平、CPA225D型天平(德國Sartorius公司);Mini spin型離心機(德國Eppendorf公司);Labnet VX-200型定時可調(diào)速渦旋混合器(美國Labnet公司);SK7200H型超聲儀(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);UNIVERSAL32R型臺式冷凍離心機(德國Hettich公司)。

    1.2 藥品與試劑

    紫杉醇對照品(批號:M1201AS,純度:98%)、文多靈對照品(批號:J1011AS,純度:98%)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;甲醇(批號:10951907818,質(zhì)譜級)、乙腈(批號:JA075930,質(zhì)譜級)均購自德國默克公司;甲酸(批號:17033D,分析純)、乙酸銨(批號:H1709024,色譜純)均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;水為屈臣氏純凈水。

    1.3 樣品

    空白腹水及含藥腹水均由上海長征醫(yī)院腫瘤科提供,分別為2例腫瘤患者未給藥和腹腔注射紫杉醇后6、8、12、24 h的腹水樣品,給藥劑量為20 mg/m2,所有患者都簽署知情同意書。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 溶液的制備

    2.1.1 貯備液的制備 分別精密稱取紫杉醇對照品2.01 mg、文多靈對照品2.00 mg,分別置于2 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的紫杉醇貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液,搖勻即得,于-20 ℃冰箱保存,備用。

    2.1.2 工作液的制備 精密量取紫杉醇貯備液適量,以10%甲醇溶液稀釋,制備成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、25.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,以及質(zhì)量濃度分別為0.625、2.5、12.5 μg/mL的質(zhì)控工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液與質(zhì)控樣品溶液的制備 取“2.1.2”項下制備的7個水平的標(biāo)準(zhǔn)工作液和3個水平的質(zhì)控工作液,分別用生理鹽水稀釋10倍,即得紫杉醇質(zhì)量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250? ? ng/mL的質(zhì)控樣品溶液。

    2.2 腹水樣品的處理

    取腹水樣品100 μL,加1 900 μL生理鹽水稀釋,渦旋30 s混勻;取稀釋樣品50 μL,置于1.5 mL的離心管中,加入含100 ng/mL內(nèi)標(biāo)的 0.1%甲酸甲醇溶液200? ? μL,渦旋混合3 min,19 751.6 ×g離心10 min,取上清液100 μL轉(zhuǎn)移至自動進樣小瓶,進樣檢測。

    2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

    色譜柱:Zorbax SB-C18(100 mm×2.1 mm,3.5 μm);流動相:水溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L 醋酸銨)-乙腈溶液(40 ∶ 60,V/V);流速:0.25 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。

    采用電噴霧離子源(ESI),多重反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)正離子模式,毛細管電壓:4 000 V,干燥氣溫度:350 ℃,干燥氣流速:10 L/min,碰撞氣壓力:40 psi,流速:10 L/min,紫杉醇和文多靈的定量分析質(zhì)荷比(m/z)分別為876.5→308.0、457.3→188.1,碎片電壓分別為250、150 V,碰撞電壓分別為30、20 eV。

    2.4 專屬性考察

    取空白腹水、空白腹水+紫杉醇對照品、含藥腹水(給藥后6 h),按“2.2”項下方法處理后,再按照“2.3”項下條件進樣測定,記錄圖譜。結(jié)果顯示,紫杉醇峰形良好,空白腹水中雜質(zhì)不干擾紫杉醇和內(nèi)標(biāo)文多靈的檢測,專屬性符合相關(guān)要求。LC-MS/MS的總離子流圖見圖2。

    2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和定量下限

    取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,按“2.2”項下方法處理后,再按照“2.3”項下條件進樣測定,每一個濃度平行做5個樣品進行分析。以紫杉醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),紫杉醇與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo) (y),進行加權(quán)線性回歸,權(quán)重系數(shù)為1/x2。得紫杉醇的回歸方程為y=0.001 8x-0.001 0(r2=0.996 5,n=7),線性質(zhì)量濃度范圍為25~2 500 ng/mL,定量下限為25 ng/mL。

    2.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗

    取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250? ? ng/mL的質(zhì)控樣品溶液,按“2.2”項下方法處理后,再按照“2.3”項下條件進樣測定,每一個濃度平行做5個樣品進行分析,連續(xù)測定3 d。根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)控樣品溶液的實測質(zhì)量濃度,考察日內(nèi)、日間精密度的RSD,并以實測質(zhì)量濃度/標(biāo)示質(zhì)量濃度×100%計算準(zhǔn)確度。精密度與準(zhǔn)確度試驗結(jié)果見表1。

    2.7 提取回收率試驗

    分別取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液,各3份,按“2.2”項下方法處理后,再按照“2.3”項下條件進樣測定,記錄峰面積A;另取空白腹水,按“2.2”項下方法處理后,加入紫杉醇對照品溶液,制備成上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品溶液,再按照“2.3”項下條件進樣測定,記錄峰面積B,以A/B×100%計算提取回收率。提取回收率試驗結(jié)果見表2。

    2.8 基質(zhì)效應(yīng)考察

    分別取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液,各3份,按“2.2”項下方法處理后,再按照“2.3”項下條件進樣測定,記錄峰面積A;另取“2.1.2”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控工作液,各3份,按照“2.3”項下條件進樣測定,記錄峰面積C,以A/C×100%計算基質(zhì)效應(yīng)?;|(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見表3。

    2.9 穩(wěn)定性試驗

    分別取“2.1.3”項下質(zhì)量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液,分別考察下列條件下的穩(wěn)定性,每一個濃度平行做3個樣品進行分析??疾鞐l件:(1)室溫條件下放置6 h,然后按“2.2”項下方法處理,再按照“2.3”項下條件進樣測定;(2)自動進樣室中放置24 h,再處理后進樣測定;(3)-20 ℃下冷凍,室溫融解,反復(fù)凍融3次,再處理后進樣測定;(4)-20 ℃下放置30 d,再處理后進樣測定。結(jié)果顯示,所有質(zhì)控樣品均未出現(xiàn)降解、變質(zhì)等變化,穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

    2.10 腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量測定

    取2例腫瘤患者腹腔注射紫杉醇后0、6、8、12、24 h的腹水樣品,紫杉醇的給藥劑量為20 mg/m2,將腹水樣品按“2.2”項下方法處理后,再按照“2.3”項下條件進樣測定,代入回歸方程計算惡性腹水中紫杉醇的含量。2例腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的藥-時曲線圖見圖3。

    3 討論

    3.1 LC-MS/MS條件的確定

    筆者參考文獻[10-12],在預(yù)實驗中分別考察了色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(100 mm×2.1 mm,3.5? ? ? ?μm)、Agilent poroshell SB C18(75 mm×2.1 mm,2.7 μm)、Waters XBridge? BEH C18(50 mm×2.1mm,2.5 μm)時,對紫杉醇含量測定的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18時,紫杉醇及內(nèi)標(biāo)的峰形最佳;流動相為乙腈/甲醇-甲酸水溶液、乙腈/甲醇-醋酸銨水溶液、乙腈/甲醇-甲酸與醋酸銨混合水溶液時,對紫杉醇含量測定的影響,結(jié)果顯示,紫杉醇在水溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸銨)-乙腈溶液(40 ∶ 60,V/V)等度洗脫的條件下響應(yīng)、峰形均較好;柱溫為20、25、30 ℃時,對紫杉醇含量測定的影響,結(jié)果顯示,柱溫越高紫杉醇的出峰時間越早,且對峰形與峰面積無明顯影響,故為了節(jié)省分析時間選擇了柱溫為30 ℃;流速為0.25、0.3 mL/min時,對紫杉醇含量測定的影響,結(jié)果顯示,紫杉醇峰面積在0.3 mL/min流速下存在峰面積下降的情況,故選擇了流速為0.25 mL/min。

    3.2 樣品的前處理

    筆者在腹水處理過程中參考并借鑒了相關(guān)文獻中紫杉醇在血漿樣本中的處理方法[13-15],結(jié)果顯示,相對于液-液萃取法,本實驗采用的蛋白沉淀法更加簡單快捷。其中,相比于乙腈,甲醇的沉淀效果更好,不易導(dǎo)致儀器系統(tǒng)壓力過高,并且在甲醇中加入少許甲酸可獲得較高的提取回收率,最終確定沉淀劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液。依據(jù)相關(guān)文獻[16-18],選擇了多種沉淀劑比例V腹水 ∶ V沉淀劑(1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6),結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)二者比例超過1 ∶ 4后,提取回收率均無明顯變化,故最終選擇沉淀劑與含0.1%甲酸的甲醇體積比為1 ∶ 4的方案。

    3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

    在內(nèi)標(biāo)選用時,筆者參考相關(guān)文獻[19],選用了與紫杉醇物理化學(xué)性質(zhì)相似的,且響應(yīng)好、穩(wěn)定的文多靈作為內(nèi)標(biāo)。

    4 結(jié)語

    綜上所述,本實驗通過對腹水樣品處理及色譜、質(zhì)譜條件進行了良好的優(yōu)化后,基于LC-MS/MS法建立了惡性腹水中紫杉醇的定量檢測方法。該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好,線性、穩(wěn)定性、提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)等符合2015年版《中國藥典》生物樣本檢測方法的要求,為未來腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的代謝研究、量效關(guān)系考察提供了研究基礎(chǔ)。

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    (收稿日期:2019-09-10 修回日期:2019-11-13)

    (編輯:鄒麗娟)

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