大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的體內(nèi)外遺傳毒性評價

文海若 顏玉靜 宋捷 鄂蕊 馬雙成 汪祺

摘 要 目的：評價大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（EG）的體內(nèi)外遺傳毒性，并比較體外細(xì)胞試驗(yàn)及大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評價結(jié)果的差異。方法：采用體外二維（2D）、三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)法分別構(gòu)建2D、3D HepaRG細(xì)胞模型，造模成功后，分別將2D、3D HepaRG細(xì)胞分為空白對照組[0.5%二甲基亞砜（DMSO）]、絲裂霉素C組（陽性對照，0.1 ?g/mL）和EG低、中、高劑量組（10、50、200 ?g/mL），然后檢測各組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量。將SD大鼠分為空白對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉）、甲磺酸乙酯組（陽性對照，200 mg/kg）和EG低、中、高劑量組（100、300、1 000 mg/kg），每組6只，連續(xù)灌胃給藥15 d，每天1次;15 d后檢測各組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率及外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞的尾DNA百分含量、尾距。結(jié)果：在體外2D HepaRG細(xì)胞模型中，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01），EG各劑量組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在3D HepaRG細(xì)胞模型中，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01或P<0.001），EG高劑量組HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01）。在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與空白對照組比較，甲磺酸乙酯組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率和外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞的尾DNA百分含量、尾距均顯著升高（P<0.01），EG高劑量組大鼠外周血淋巴細(xì)胞尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01），EG各劑量組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率和肝細(xì)胞尾DNA百分含量、尾距差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但隨劑量增加有升高趨勢。結(jié)論：本研究結(jié)果提示在2D細(xì)胞模型中，EG未導(dǎo)致染色體斷裂及DNA損傷，但3D細(xì)胞模型長期給藥和體內(nèi)重復(fù)給藥結(jié)果均顯示EG存在一定DNA損傷風(fēng)險，故3D HepaRG細(xì)胞模型的評價結(jié)果更接近大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

關(guān)鍵詞 大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷;遺傳毒性;HepaRG細(xì)胞;二維培養(yǎng);三維培養(yǎng);大鼠;微核試驗(yàn)

中圖分類號 R994 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）01-0018-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.04

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To evaluate the in vitro and in vivo genotoxicity of emodin-8-O-β-D-glucoside （EG）， and to compare the difference of in vitro cell test and in vivo test of rats. METHODS： 2D and 3D hepatocyte models were established by in vitro two-dimensional （2D） and three-dimensional （3D） cell culture. After modeling， 2D and 3D hepatocyte were divided into blank control group （0.5% DMSO）， mitomycin C group （positive control， 0.1 ?g/mL）， EG low-dose， medium-dose and high-dose groups （10， 50， 200 ?g/mL）， respectively. The micronucleus ratio and tail DNA% of HepaRG cells were detected. SD rats were divided into blank control group （0.5% sodium carboxymethyl cellulose）， ethyl methanesulfonate group （positive control， 200? ?mg/kg）， EG low-dose， medium-dose and high-dose groups （100， 300， 1 000 mg/kg）， with 6 rats in each group. They were given medicine intragastrically for consecutive 15 d， once a day. 15 days later， the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes， the tail DNA% and tail distance of peripheral blood lymphocytes and hepatocytes were measured. RESULTS： In the in vitro 2D HepaRG hepatocyte model， compared with blank control group， the micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell were increased significantly in mitomycin C group （P<0.01）. There was no statistical significance in micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell among EG groups （P>0.05）. In 3D HepaRG cell model， compared with blank control group， micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell were increased significantly in mitomycin C group （P<0.01 or P<0.001）， while tail DNA% of HepaRG cell was increased significantly in EG high-dose group （P<0.01）. In the in vivo test， compared with blank control group， the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes， the tail DNA% and tail distance of peripheral blood lymphocytes and hepatocytes were all increased significantly in ethyl methanesulfonate group （P<0.01）. Tail DNA% of peripheral blood lymphocytes was increased significantly in EG high-dose group （P<0.01）. There was no statistical significance in the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes， the tail DNA% and tail distance of hepatocytes among EG groups （P>0.05）; with the increase of dose， there was an increasing trend. CONCLUSIONS： The results of this study suggest that in 2D cell model， EG not lead to chromosome breakage and DNA damage， but the long-term administration and repeated administration in vivo of 3D cell model show that EG has a certain risk of DNA damage， so the evaluation results of 3D HepaRG cell model are more similar to those of rats in vivo.

KEYWORDS? ?Emodin-8-O-β-D-glucoside; Genotoxicity; Two-dimensional culture; Three-dimensional culture; Rat; Micronucleus test

肝臟是人體最主要的代謝及解毒器官，藥源性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）已成為藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)[1]。隨著近年來臨床不斷出現(xiàn)含蒽醌類成分的中藥致肝損傷的案例報道[2]，學(xué)界對蒽醌的肝損傷機(jī)制展開廣泛研究。目前已有體外研究數(shù)據(jù)提示，蒽醌類化合物存在遺傳毒性風(fēng)險和致突變作用[3]。課題組前期研究中也證實(shí)大黃素可誘導(dǎo)正常人源肝細(xì)胞HepaRG染色體損傷和DNA斷裂，在體外彗星及微核試驗(yàn)中呈陽性結(jié)果[4]。蒽醌類的潛在遺傳毒性，尤其是肝臟腫瘤發(fā)生風(fēng)險有待深入探索。

大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（Emodin-8-O-β-D-glucoside，EG）是大黃素在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物及形式[5]，其原型同樣存在于大黃、何首烏、虎杖、決明子、冬凌草等中藥中且含量較高[6]。以何首烏為例，不同產(chǎn)地的何首烏藥材中EG的含量最高可達(dá)0.42%[7]。文獻(xiàn)報道EG可有效提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿含量，保護(hù)神經(jīng)元損傷，對阿爾茨海默病有一定改善，臨床應(yīng)用較為廣泛。然而作為蒽醌類化合物，EG含有的羥基蒽醌結(jié)構(gòu)屬于遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與DNA堿基類似，使其可嵌入DNA鏈并導(dǎo)致沙門氏菌（尤其是TA1537菌株）回復(fù)性突變[8]。EG的遺傳毒性風(fēng)險不容小覷，但目前關(guān)于EG的毒性及致癌性風(fēng)險缺乏充足的試驗(yàn)研究。

嚙齒類動物在毒性研究中獨(dú)具優(yōu)勢，但是大量開展體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)成本較高且不符合替代毒理學(xué)減少動物使用的理念，因此，使用體外模型進(jìn)行藥物毒性初篩及作用機(jī)制的初步研究十分必要。HepaRG細(xì)胞是從慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌患者體內(nèi)非瘤組織分離而得的細(xì)胞株，能表現(xiàn)人肝細(xì)胞的大多數(shù)功能，其體外二維（Two-dimension，2D）培養(yǎng)模型是常用的體外肝毒性評價工具[9]。本課題組前期研究證實(shí)HepaRG細(xì)胞可在不額外添加代謝活化劑的情況下較好地代謝藥物，在了解以肝臟為靶器官遺傳毒性方面獨(dú)具優(yōu)勢[10]。但2D模型缺乏細(xì)胞-細(xì)胞接觸和細(xì)胞-胞外基質(zhì)間的聯(lián)系，長時間培養(yǎng)會出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象[11]。利用懸滴技術(shù)構(gòu)建的三維（Three-dimension，3D）HepaRG多細(xì)胞聚球體模型則可長期培養(yǎng)，并能夠保持較高的白蛋白分泌水平和肝藥酶活性[12]，從而更好地模擬藥物體內(nèi)代謝條件，提供更有價值的評價數(shù)據(jù)。

本研究同時利用體外2D、3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型和大鼠體內(nèi)重復(fù)給藥試驗(yàn)評價EG的遺傳毒性，并比較3種評價結(jié)果的差異，以期為EG的臨床合理應(yīng)用和毒性評價方法的選擇提供參考。

1 材料

1.1 儀器

懸滴GravityPlusTM和GravityTRAPTM板（瑞士Insphero 公司）;VICTOR X5多功能酶標(biāo)儀（英國Perkin Elmer 公司）;5180R臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;NTS-1300恒溫振蕩水槽（東京理化器械株式會社）;DYCP-31F電泳儀（北京市六一儀器廠）;CX41三目生物顯微鏡（日本Olympus公司）;eclipse 80i熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Komet 6.0 圖像分析系統(tǒng)（英國安道爾科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

EG（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：17110201，純度：98.0%）;甲磺酸乙酯（批號：141970611309162）、細(xì)胞松弛素B（批號：2989720）、二甲基亞砜（DMSO，批號：RNBG7476）均購自美國Sigma-Aldrich公司;磷酸鹽緩沖液（批號：AD19942268）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號：AE27856292）、Giemsa 染料（批號：SLBT6353）均購自美國Hyclone公司;胰蛋白酶消化液（批號：1974026）、胎牛血清（批號：1908121）均購自美國Gibco公司;絲裂霉素C（日本東京化成株式會社，批號：AKZ8O-EF）;羧甲基纖維素鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20170830）;彗星分析試劑盒（美國Trevigen公司，批號：P191587）;Hanks平衡鹽溶液 （美國Corning公司，批號：28417007）; SYBR Gold 核酸凝膠染液（美國Invitrogen公司，批號：1987319）;吖啶橙（美國Fluka公司，批號：930226）。

1.3 細(xì)胞

HepaRG人源肝細(xì)胞系購自美國Thermo Fisher Scientific公司，本試驗(yàn)所用細(xì)胞為第11～12代。

1.4 動物

SPF級SD大鼠30只，5～6周齡，均為♂。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。在恒溫（20～26 ℃）、恒濕（40%～70%）、各12 h明暗周期的條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)密度為2～3只/籠。提供經(jīng)鈷60放射滅菌的鼠全價顆粒飼料，自由攝食及飲水，取材前不禁食禁水。本研究方案通過國家藥物安全評價監(jiān)測中心實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會（Institutional animal care and use committee，IACUC）審查。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥濃度確定

在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種5 000個HepaRG細(xì)胞，孵育18～24 h后給藥。分別設(shè)置空白對照組（0.5% DMSO）和EG給藥組（給藥濃度分別為324、162、81、27、9、3 ?g/mL），于37 ℃，5%CO2的條件下孵育24 h后，即得2D HepaRG細(xì)胞模型，然后每孔加入等體積的三磷酸腺苷檢測試劑，輕輕晃動，室溫平衡10 min后，采用酶標(biāo)儀檢測各孔的三磷酸腺苷發(fā)光強(qiáng)度，并計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（EG各給藥組發(fā)光強(qiáng)度/空白對照組發(fā)光強(qiáng)度）×100%，再根據(jù)濃度與存活率關(guān)系曲線計(jì)算EG 的IC50。結(jié)果，2D HepaRG細(xì)胞模型中EG的IC50為205.4 ?g/mL，因此，將后續(xù)體外2D HepaRG細(xì)胞模型評價試驗(yàn)中的EG高濃度設(shè)置為200 ?g/mL，由于體外3D HepaRG細(xì)胞模型評價試驗(yàn)中的給藥時間長，給藥濃度不應(yīng)高于體外2D HepaRG細(xì)胞模型評價試驗(yàn)，為保證EG在不同體外細(xì)胞模型中的可比性，本研究EG在2D、3D HepaRG細(xì)胞模型中給藥濃度保持一致。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

微核試驗(yàn)、堿性彗星試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式列出。彗星試驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn);微核試驗(yàn)結(jié)果采用Poisson分布法檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)圖與統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)GraphPad Prism 7軟件處理生成。

2.3 體外細(xì)胞試驗(yàn)評價EG遺傳毒性

2.3.1 體外2D HepaRG細(xì)胞模型評價EG遺傳毒性

（1）微核試驗(yàn)。調(diào)整HepaRG細(xì)胞濃度為5×105 mL-1，取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加2 mL培養(yǎng)液/細(xì)胞混合液，置37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)18～24 h。細(xì)胞達(dá)對數(shù)生長期時，將其分為空白對照組（0.5%DMSO）、絲裂霉素C組（陽性對照，0.1 ?g/mL）及EG低、中、高劑量組（10、50、200 ?g/mL），處理24 h后更換含細(xì)胞松弛素B（2 ?g/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)40 h。收獲細(xì)胞并加入0.075 mol/L的氯化鉀溶液2 mL，室溫低滲處理5 min;加入固定液（無水甲醇 ∶ 無水乙酸=3 ∶ 1，V/V）5 mL固定， 1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)固定2次，每個樣品滴片制備2張標(biāo)本并編號。固定后的玻片標(biāo)本浸入5% Giemsa應(yīng)用液中，染色25～30 min之后置于超純水中沖洗干凈，室溫下自然干燥。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每張玻片標(biāo)本中每500個雙核細(xì)胞中含微核的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核形成率，微核形成率=（含微核雙核細(xì)胞數(shù)/觀察雙核細(xì)胞總數(shù)）×100%[13]。

（2）堿性彗星試驗(yàn)。HepaRG細(xì)胞處理及給藥方法同“2.3.1（1）”項(xiàng)下微核試驗(yàn)，收獲細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105 mL-1，將收獲的細(xì)胞進(jìn)行制片、裂解、解旋、電泳、中和、脫水等處理后制成單細(xì)胞凝膠標(biāo)本，每組制備3張標(biāo)本。所有標(biāo)本使用SYBR Green I（1 ∶ 10 000）染色，并在熒光顯微鏡下拍照（放大倍數(shù)200～400）。再使用Komet 6.0彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析，每個標(biāo)本至少分析100個彗星細(xì)胞的尾DNA百分含量并計(jì)算中位數(shù)。

結(jié)果，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01），且其微核形成率和尾DNA百分含量在文獻(xiàn)報道的范圍內(nèi)[13]，也表明體外2D HepaRG細(xì)胞模型構(gòu)建成功;EG各劑量組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。體外2D HepaRG細(xì)胞模型的微核形成率及尾DNA百分含量測定結(jié)果見圖1。

2.3.2 體外3D細(xì)胞模型評價EG遺傳毒性

參考盧賢歡等[8]的3D懸滴細(xì)胞模型培養(yǎng)方法構(gòu)建體外3D HepaRG細(xì)胞模型，將HepaRG經(jīng)2%DMSO高密度誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，接種于GravityPlusTM板以懸滴法培養(yǎng)4 d;待形成肝細(xì)胞微球后加入培養(yǎng)液并將其轉(zhuǎn)移至Gravity TRAPTM板中;隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)10 d，即得3D HepaRG細(xì)胞模型;然后分為空白對照組（0.5%DMSO）、絲裂霉素C組（陽性對照，6 ?g/mL）和EG低、中、高劑量組（10、50、200 ?g/mL），連續(xù)給藥3次，每次48 h，最后1次給藥時加入含細(xì)胞松弛素B（6 ?g/mL）的培養(yǎng)基。然后收集各組細(xì)胞，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行微核試驗(yàn)與堿性彗星試驗(yàn)。

結(jié)果，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01或P<0.001），EG高劑量組HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01），且隨著EG劑量的增加，3D HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量升高，存在劑量效應(yīng)相關(guān)性;EG各劑量在3D HepaRG細(xì)胞模型微核試驗(yàn)結(jié)果雖為陰性，但微核形成率隨給藥劑量增加有升高趨勢。體外3D HepaRG細(xì)胞模型的微核形成率及尾DNA百分含量測定結(jié)果見圖2。

2.4 大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評價EG遺傳毒性

2.4.1 大鼠分組及給藥

30只大鼠分為空白對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）、甲磺酸乙酯組（陽性對照，200 mg/kg，給藥劑量參考文獻(xiàn)[14]，給藥時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃溶液，甲磺酸乙酯為檢測體內(nèi)DNA斷裂或染色體損傷時最常用陽性對照，故體內(nèi)研究選擇甲磺酸乙酯作為陽性對照）和EG低、中、高劑量組（100、300、1 000 mg/kg，給藥劑量參考文獻(xiàn)[15]，給藥時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃溶液），每組6只。連續(xù)灌胃給藥15 d，每天1次，給藥體積為15 mL/kg，末次給藥3 h后所有大鼠以CO2吸入法麻醉，從腹腔后大靜脈取血用于彗星試驗(yàn)，采血量約0.5 mL/只。

2.4.2 微核試驗(yàn)

（1）骨髓微核試驗(yàn)。將大鼠處死后，取其單側(cè)股骨，剪斷兩端開放骨髓腔;吸取胎牛血清約1～2 mL，使用注射器針頭沖洗骨髓至試管中，并反復(fù)抽吸針頭數(shù)次吹打制成骨髓細(xì)胞懸液，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后，棄去大部分上清液，將骨髓細(xì)胞沉淀吹打均勻;吸取適量骨髓細(xì)胞懸液滴于潔凈玻片上推片，標(biāo)本置于室溫下干燥，再經(jīng)甲醇固定15 min后晾干待檢[14]。每只大鼠骨髓細(xì)胞樣本計(jì)數(shù)200個總紅細(xì)胞中的嗜多染紅細(xì)胞的數(shù)目，以及2 000個嗜多染紅細(xì)胞中含微核細(xì)胞的數(shù)目，分別計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的百分率以及嗜多染紅細(xì)胞的微核形成率。

（2）肝臟微核試驗(yàn)。取大鼠肝左葉約5 mm3大小組織，用刀片切成2～3 mm3小塊，加入含0.05%膠原酶的HBSS溶液，于37 ℃水浴中振搖孵育1 h，每30 min人工用力振搖1次，再用移液器反復(fù)吹打消化后的細(xì)胞懸液50次，再經(jīng)40 μm細(xì)胞篩過濾后，加入3 mL固定液（無水甲醇 ∶ 冰醋酸=3 ∶ 1，V/V）固定，并以800 r/min離心1 min;棄上清，再次加入3 mL固定液并重懸，樣本于4 ℃條件保存待檢。鏡檢前，取10～20 μL細(xì)胞懸液，加入等體積的吖啶橙-DAPI溶液進(jìn)行熒光染色;染色后，取10～20 μL混合液滴片后加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。每只大鼠的樣本計(jì)數(shù)1 000個含微核的肝細(xì)胞，計(jì)算肝細(xì)胞微核率。

結(jié)果，與空白對照組比較，甲磺酸乙酯組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率均顯著升高（P<0.01），EG各劑量組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞/總紅細(xì)胞比例和嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但隨著EG劑量的增加，嗜多染紅細(xì)胞微核形成率及肝細(xì)胞微核形成率均有所增加，存在劑量效應(yīng)相關(guān)性。各組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞/總紅細(xì)胞比例和嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞微核形成率的測定結(jié)果見表1。

2.4.3 堿性彗星試驗(yàn)

采集大鼠外周血約50 μL備用。肝組織樣本采集肝左葉約2～3 mm3大小組織置于3 mL切碎液（含20 mmol/L EDTA-2Na和10% DMSO的Hanks平衡溶液）中并使用剪刀剪碎組織以釋放細(xì)胞，經(jīng)40 μm細(xì)胞篩過濾后置于冰上備用。取外周血淋巴細(xì)胞和肝細(xì)胞參考“2.3.1（2）”和“2.3.2”項(xiàng)下方法，分別進(jìn)行體外2D、3D細(xì)胞模型的堿性彗星試驗(yàn)，測尾DNA百分含量和尾距（尾距=尾DNA百分含量×頭部中心至尾部中心的距離）。結(jié)果，與空白對照組比較，甲磺酸乙酯組大鼠外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞的尾DNA百分含量、尾距均顯著升高（P<0.01），EG高劑量組大鼠外周血淋巴細(xì)胞尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01），EG各劑量組大鼠肝細(xì)胞的微核形成率和肝細(xì)胞尾DNA百分含量、尾距差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），由此可知，EG對外周血淋巴細(xì)胞的染色體或DNA損傷效應(yīng)強(qiáng)于肝細(xì)胞。各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞尾DNA 百分含量及尾距的測定結(jié)果見表2。

3 討論

遺傳毒性試驗(yàn)通常平行設(shè)置陽性對照，確保試驗(yàn)體系的可靠性。本研究根據(jù)文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)在體內(nèi)及體外研究中選擇不同陽性對照，證實(shí)試驗(yàn)體系成立、評價結(jié)果可信。絲裂霉素C為體外微核試驗(yàn)常用陽性對照藥，可在非代謝活化條件下誘導(dǎo)微核試驗(yàn)呈陽性結(jié)果[13]。鑒于當(dāng)前針對體外彗星試驗(yàn)，尤其是3D模型彗星試驗(yàn)的文獻(xiàn)報道較少，且微核試驗(yàn)所用陽性對照藥及濃度范圍通常可兼顧彗星試驗(yàn)，故使用絲裂霉素C同時作為體外微核和彗星試驗(yàn)的陽性對照藥[16]。甲磺酸乙酯是以體內(nèi)染色體和DNA損傷為檢測終點(diǎn)時常用的陽性對照藥，同時也是體內(nèi)彗星試驗(yàn)聯(lián)合驗(yàn)證的指定陽性對照[17]，故本研究將其作為體內(nèi)微核和彗星試驗(yàn)的陽性對照。

研究EG的致癌性風(fēng)險對于臨床安全用藥具有重要指導(dǎo)意義。本研究首次同時利用體外2D、3D細(xì)胞模型及大鼠連續(xù)15 d體內(nèi)重復(fù)給藥試驗(yàn)評價EG的遺傳毒性風(fēng)險。體內(nèi)研究在傳統(tǒng)骨髓微核試驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加肝微核試驗(yàn)，并平行取外周血及肝組織開展彗星試驗(yàn)。肝微核試驗(yàn)可同時考察毒性靶組織及藥物代謝產(chǎn)物的遺傳毒性，尤其在代謝產(chǎn)物體內(nèi)遺傳毒性評價方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在體外3D HepaRG細(xì)胞模型中，EG高劑量組HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量與空白對照組相比顯著升高，且尾DNA百分含量與EG濃度存在明顯的劑量效應(yīng)相關(guān)性;微核試驗(yàn)結(jié)果雖為陰性，但可見類似趨勢。體內(nèi)研究中，盡管EG在傳統(tǒng)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)中呈陰性，但各劑量組微核形成率隨劑量升高有一定升高趨勢，且與肝微核試驗(yàn)結(jié)果基本相符;此外，EG高劑量組可導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞DNA明顯損傷，各劑量組之間呈劑量效應(yīng)相關(guān)性，肝細(xì)胞彗星試驗(yàn)結(jié)果為陰性但可見類似趨勢。2項(xiàng)研究中外周血淋巴細(xì)胞均較肝細(xì)胞更為敏感，可見EG可與外周血淋巴細(xì)胞DNA相互作用，存在一定遺傳毒性風(fēng)險。相關(guān)體外和體內(nèi)研究報道，含蒽醌環(huán)的化合物可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)斷裂、并導(dǎo)致微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，如大黃素可誘導(dǎo)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成率升高[19]，可導(dǎo)致體外培養(yǎng)人淋巴母細(xì)胞和肝細(xì)胞DNA斷裂[4，20]。大黃素和大黃酸可誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞tk基因突變率增加[20]，蘆薈大黃素在排泄過程中可導(dǎo)致腎細(xì)胞和結(jié)腸細(xì)胞的DNA斷裂等[21]。分析原因認(rèn)為與蒽醌結(jié)構(gòu)可與Topo Ⅱ（Topoisomerase Ⅱ，Topo Ⅱ）的三磷酸腺苷結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合并抑制Topo Ⅱ的活性，從而導(dǎo)致該復(fù)合物不易解離及DNA鏈斷裂 [19]。此外，也有研究顯示，蒽醌類化合物經(jīng)Ⅰ相代謝后其遺傳毒性更強(qiáng)，如在體外試驗(yàn)中添加大鼠肝微粒體酶S9后（S9混合物配方中僅含啟動Ⅰ相代謝反應(yīng)的底物），其中蘆薈大黃素可誘導(dǎo)更多回復(fù)性菌落形成[15]。有研究根據(jù)大鼠灌胃EG后，在血漿、尿和糞便樣本中均可檢測到大黃素，推測EG在體內(nèi)先水解為大黃素后再以游離蒽醌形式進(jìn)一步在體內(nèi)代謝[22]。因此，EG體內(nèi)遺傳毒性物質(zhì)基礎(chǔ)可能與分子量較小的含蒽醌母核的化合物有關(guān)，該結(jié)論有待經(jīng)體內(nèi)代謝及組織分布研究證實(shí)。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，EG對體外2D HepaRG細(xì)胞模型無明顯致染色體斷裂及DNA損傷風(fēng)險，而3D細(xì)胞模型對其具有明顯損傷，提示體外3D肝細(xì)胞模型的評價結(jié)果更接近于體內(nèi)試驗(yàn)。體外3D肝細(xì)胞模型現(xiàn)已被應(yīng)用于藥物研發(fā)過程中的藥物評估[23-24]。體外3D肝細(xì)胞模型可長期培養(yǎng)，且能保持肝狀類似結(jié)構(gòu)和組織代謝活動[25-26]，在重復(fù)給藥的體外肝毒性評價方面具有一定的優(yōu)勢。本研究的結(jié)果也表明，體外3D肝細(xì)胞模型是良好的體外毒性評價方法，其評價結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相似，可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行肝毒性藥物的早期篩選。

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（收稿日期：2019-07-01 修回日期：2019-09-16）

（編輯：唐曉蓮）