魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備及質(zhì)量控制方法研究

邱連建， 朱衛(wèi)星， 陳會(huì)朋

[1.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗），廣東深圳 518000；2.清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東清遠(yuǎn) 511500]

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分。味辛，性微寒，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功效[1]。臨床上常與其他中藥配伍用于治療肺炎、支氣管炎、流行性腮腺炎、咽炎、風(fēng)熱型急性卡他性結(jié)膜炎、病毒性腸炎等疾病[2-4]，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。其化學(xué)成分有生物堿、黃酮類、有機(jī)酸、揮發(fā)油類等[5]。2015年版《中華人民共和國藥典》[1]（以下簡稱《中國藥典》）以甲基正壬酮為對(duì)照，利用薄層色譜對(duì)魚腥草進(jìn)行定性鑒別，并規(guī)定了魚腥草浸出物限度，但缺乏相應(yīng)的有效成分含量控制指標(biāo)，因此，魚腥草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待于進(jìn)一步的提高與完善。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，按照傳統(tǒng)煎藥方式進(jìn)行煎煮得到的單味中藥飲片水煎劑，用于制定中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證中藥配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一致性[6]。因此，本研究從標(biāo)準(zhǔn)湯劑角度，以市場上收集的24批魚腥草飲片為原料，按照全草類中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝，進(jìn)行魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究，建立了魚腥草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，以及有效成分槲皮苷的含量測定，以期為魚腥草配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1儀器與試劑Waters高效液相色譜儀，Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀，CHEMSTATION C.01.04化學(xué)工作站，Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm ×250 mm，5μm）色譜柱，Phenonmenex Luna-C18色譜柱；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平（梅特勒—托利多公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。甲醇、乙醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司），為分析純；液相用甲醇、乙腈（德國默克股份有限公司），為色譜純；磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），為色譜純；超純水（取自實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)，德國默克股份有限公司）。

1.2試藥綠原酸（含量96.2%，批號(hào)：110753-201415）、金絲桃苷（含量93.3%，批號(hào)：111521-201205）、槲皮苷（含量90.6%，批號(hào)：111538-201606）均由中國食品藥品檢定研究院提供。隱綠原酸（含量≥98%，批號(hào)：15121701）、新綠原酸（含量≥98%，批號(hào)：151217）均來自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

1.3樣品分別收集了3個(gè)產(chǎn)地共24批魚腥草樣品，樣品經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)檢中心鑒定為魚腥草。按照2015年版《中國藥典》進(jìn)行含量測定。樣品信息及含量測定結(jié)果見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備取魚腥草飲片100 g，加水煎煮2次，第1煎加水14倍量，浸泡30 min，保沸20 min，350目篩網(wǎng)濾過。第2煎加水12倍量，保沸15 min，350目篩網(wǎng)濾過。合并2次濾液，減壓濃縮至250 mL流浸膏，真空冷凍，即得。

表1 魚腥草藥材與飲片信息表Table 1 Data of Herba Houttuyniae materials and crude slices

2.2出膏率測定量取煎煮液總體積V（室溫），攪拌均勻后精密吸取25 mL提取液至干燥恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中。水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，干燥器中冷卻后，迅速精密稱定質(zhì)量m1。藥材質(zhì)量為m2。測出膏率＝（m1×V）/（0.025×m2）×100%。計(jì)算平均出膏率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，24批魚腥草標(biāo)準(zhǔn)湯劑平均出膏率為17.40%，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）為1.41%。《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》允許出膏率為均值的70%～130%或均值加減3倍的SD，因此，魚腥草標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率范圍為12.18%～22.62%或13.17%～21.63%。

2.3魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定

2.3.1 色譜條件色譜柱：Kromasil-C18（4.6 mm×25 cm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈—0.1%磷酸水（23∶77）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

表2 24批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的測定Table 2 The extraction rate of twenty-four batches of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction（p/%）

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 取槲皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇制成質(zhì)量濃度為30μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.1 g，精密稱定，精密加入50 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解并超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 以“2.3.2”項(xiàng)下的槲皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液為基礎(chǔ)，依次配制濃度為15.0、7.5、3.7、1.8、0.9μg/mL的溶液。分別精密吸取10μL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣記錄峰面積。以槲皮苷對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：y=27.88x-3.520，R2=1。結(jié)果表明在0.973～31.137 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)照品濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取槲皮苷對(duì)照品（31.137μg/mL），按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰保留時(shí)間和峰面積值，計(jì)算槲皮苷的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.09%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S1），精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下平行制備供試品溶液6份。精密吸取10μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果顯示魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中槲皮苷平均含量為6.16 mg/g，RSD為1.86%，表明該分析方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（S1），按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、30 h進(jìn)樣，測定供試品溶液中槲皮苷的峰面積，計(jì)算峰面積RSD為0.41%。結(jié)果表明，供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1）約0.05 g，精密稱定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中槲皮苷的含量按1∶1的比例添加槲皮苷對(duì)照品，按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成加樣回收供試品溶液6份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)。計(jì)算供試品溶液中槲皮苷的平均加樣回收率為101.48%，RSD為0.87%，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.9 魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定及轉(zhuǎn)移率 取所制備的24批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，每批平行2份。按“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，每份精密吸取10μL按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算槲皮苷含量，根據(jù)公式計(jì)算：轉(zhuǎn)移率（%）=結(jié)果表明，24批魚腥草標(biāo)準(zhǔn)湯劑槲皮苷平均含量為6.94 mg/g，槲皮苷含量范圍為4.86～9.02 mg/g，槲皮苷轉(zhuǎn)移率均值為46.28%，槲皮苷轉(zhuǎn)移率范圍為32.40%～60.16%。

表3 24批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑槲皮苷含量及轉(zhuǎn)移率Table 3 The content and transfer rate of quercetin in twenty-four batches of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

2.4指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件YMC-Triart C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：0～30 min為326 nm，30～80 min為254 nm；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸水為流動(dòng)相B，按表4規(guī)定的梯度進(jìn)行洗脫，流速為1.0 mL/min。

表4 魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜梯度洗脫程序Table 4 The gradient elution procedure for characteristic spectrum of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

2.4.2 供試品溶液制備 取魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑約0.1 g，精密稱定，精密加入25 mL的體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶解，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（S18），按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積10μL。以2號(hào)峰綠原酸為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.29%，表明該特征圖譜的精密度較好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S18）約0.1 g，精密稱定，平行6份，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10μL，以2號(hào)峰綠原酸為參照，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示各峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.15%，表明該特征圖譜的重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S18）項(xiàng)下供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣10μL，以2號(hào)峰綠原酸為參照，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示24 h內(nèi)各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2.0%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 樣品檢測與分析 分別取24批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別測定及記錄高效液相色譜（HPLC）指紋圖，見圖1。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)24批魚腥草標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜進(jìn)行共有峰標(biāo)識(shí)，經(jīng)分析找到了6個(gè)共有峰，其中經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)，指認(rèn)了其中5個(gè)峰，分別是峰1：新綠原酸；峰2：綠原酸；峰3：隱綠原酸；峰5：金絲桃苷；峰6：槲皮苷。見圖2。

圖1 24批魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜Figure 1 HPLC fingerprints of twenty-four batches of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

圖2 魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜Figure 2 The characteristic spectrum of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

3 討論

本研究考察并建立了魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制方法。

3.1供試品處理考察對(duì)魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑前處理重點(diǎn)考察了提取溶劑及提取時(shí)間。溶劑種類中考察了水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、乙醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特征圖譜樣品中6個(gè)共有特征峰“總峰面積/稱樣量”比值以50%甲醇作為溶劑時(shí)最大，且各峰的分離效果最優(yōu)；含量測定樣品中以50%甲醇作為溶劑時(shí)提取效率最高。因此均選擇50%的甲醇作為提取溶劑。超聲提取不同時(shí)間（15、30、45、60 min）的特征圖譜色譜峰數(shù)目、分離度及特征圖譜6個(gè)特征峰“總峰面積/稱樣量”無明顯差異，超聲30 min已經(jīng)基本提取完全，且超聲提取30 min槲皮苷含量最高，最終均確定超聲提取時(shí)間為30 min。

3.2魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制本研究主要從3個(gè)方面對(duì)魚腥草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制進(jìn)行把關(guān)：①藥材的選擇涵蓋了魚腥草的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)檢測均符合2015年版《中國藥典（一部）》的相關(guān)項(xiàng)下要求，所選樣品從產(chǎn)地、質(zhì)量水平等方面均具有代表性。②標(biāo)準(zhǔn)湯劑參照國家藥典委員會(huì)制定的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》和國家中醫(yī)藥管理局制定的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》進(jìn)行制備，與傳統(tǒng)湯藥在藥效和成分上保持一致。③中藥是由多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用的，采用指標(biāo)成分結(jié)合指紋圖譜方法控制魚腥草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量，克服了傳統(tǒng)采用1～2種成分含量控制中藥質(zhì)量的不合理性。

2015年版《中國藥典》以甲基正壬酮為對(duì)照，利用薄層色譜對(duì)魚腥草進(jìn)行了定性鑒別，但缺乏相應(yīng)的有效成分含量控制指標(biāo)，揮發(fā)油的量也未進(jìn)行控制，因此，魚腥草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待于進(jìn)一步的提高與完善?？紤]到魚腥草中揮發(fā)油的含量極低，以及以干魚腥草作為原料，在制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑過程中造成揮發(fā)油的損失，采用揮發(fā)油中的有效成分作為含量控制指標(biāo)存在一定的困難。魚腥草中含有多種黃酮類成分，包括槲皮素、槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等，具有殺菌、祛痰、止咳、抗炎、抗過敏等作用，通過對(duì)魚腥草特征圖譜研究，發(fā)現(xiàn)槲皮苷峰型最高，且分離效果良好。已有文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮苷具有抗病毒、抗炎、利尿等作用[7-8]，是魚腥草的主要有效成分之一，采用槲皮苷作為魚腥草的含量控制指標(biāo)也有一定的文獻(xiàn)基礎(chǔ)[9-14]。因此，本研究采用HPLC測定魚腥草中槲皮苷的含量，作為魚腥草的含量控制指標(biāo)。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑失去了原有飲片的形態(tài)學(xué)特征，單純的指標(biāo)成分的定性和定量分析難以反映其質(zhì)量的優(yōu)劣，故中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制要重視以指紋圖譜為主的整體質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)選用不同產(chǎn)地的24批魚腥草制備魚腥草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，考察槲皮苷含量，并建立其HPLC指紋圖譜，從指標(biāo)成分定量和整體定性的角度對(duì)魚腥草進(jìn)行全面質(zhì)量控制。本方法準(zhǔn)確、可行、重復(fù)性良好，可為所有源于魚腥草湯劑制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。