參芪扶正注射液通過下調(diào)MMP-2表達抑制口腔鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移

張樂琪， 譚蕾， 羅晶， 鄧春妮， 劉治

（西安交通大學第一附屬醫(yī)院口腔科，陜西西安 710061）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是指發(fā)生于口腔內(nèi)以鱗狀細胞為主的惡性腫瘤，具有高復發(fā)率和高頻率淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點[1]。盡管手術、化療和靶向治療取得了較大的進展，但由于其易遠處轉(zhuǎn)移，OSCC仍有很高的復發(fā)率[2]。因此，減少OSCC的轉(zhuǎn)移是治療OSCC和改善患者預后的有效策略。參芪扶正注射液是由傳統(tǒng)中藥材黨參和黃芪為主要原料，提取分離總皂苷和黃芪甲苷等主要有效成分精制而成的中藥注射液，具有益氣養(yǎng)陰、扶正固本的功效[3]。既往藥理學研究表明，參芪扶正注射液在臨床上常作為腫瘤治療的輔助藥物，具增加腫瘤抑制的作用，并能減輕各種毒副反應[4-5]。故本研究觀察參芪扶正注射液對OSCC的治療作用及其對OSCC遠處轉(zhuǎn)移的影響，以期為臨床治療OSCC提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞來源及培養(yǎng)人口腔鱗狀細胞癌SCC-25細胞，購自上海匹拓生物科技有限公司。SCC-25細胞在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，以含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2動物來源及飼養(yǎng)40只SPF級3～4周齡雌性BALB/c-nu/nu裸鼠，體質(zhì)量16～22 g，購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SYXK（川）2017-203。飼養(yǎng)在西安交通大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室，溫度控制在25℃左右、濕度在50%左右，裸鼠在實驗前均予普通飼料適應性喂養(yǎng)1周。

1.3藥物、試劑與儀器參芪扶正注射液（麗珠集團利民制藥廠，批號：國藥準字Z19990065）；順鉑（浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：PHR1624）。RPMI-1640培養(yǎng)液（上海栩冉生物科技有限公司）；RIPA裂解緩沖液（南京?？藸柹锟萍加邢薰荆?；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司）；基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）抗體、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）抗體、磷酸化ERK（p-ERK）抗體（英國Abcam公司）；c-Raf抗體（上海博研生物科技有限公司）；p-c-Raf抗體（上海邦景實業(yè)有限公司）；絲裂原激活蛋白激酶激酶（MEK）抗體（康朗生物有限公司）；磷酸化MEK（p-MEK）抗體（南京厚百電子商務有限公司）；pc-MMP2質(zhì)粒（上海生物工程有限公司）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（上海恪敏生物科技有限公司）；QIAzol裂解試劑（北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）。Elx800酶標儀（美國Biotek公司）；DYCZ-40G型轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠）；FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple公司）。

1.4體外實驗

1.4.1 應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法觀察參芪扶正注射液的細胞毒性 將SCC-25細胞接種到24孔板上，用0～80μg·mL-1參芪扶正注射液37℃處理24 h。再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，加MTT 0.5 g·L-1溫育4 h后，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO）在搖床低速振蕩10 min，應用分光光度法于570 nm波光處測定吸光度。

1.4.2 細胞分組及處理 ①實驗1：設置空白對照組，順鉑組，參芪扶正低、中、高劑量組。其中：空白對照組SCC-25細胞正常培養(yǎng)；順鉑組用含有40μg·mL-1順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)[6]；參芪扶正低、中、高劑量組分別用含有10、20、40μg·mL-1參芪扶正注射液的培養(yǎng)基培養(yǎng)[6]。②實驗2：設置空白對照組、參芪扶正高劑量組、MMP2高表達組、MMP2+參芪扶正組。其中：空白對照組和參芪扶正高劑量組處理同“實驗1”；MMP2高表達組應用LipofectamineTM2000試劑將pc-MMP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SCC-25細胞，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；MMP2+參芪扶正組應用LipofectamineTM2000試劑將pc-MMP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SCC-25細胞，用含有40μg·mL-1參芪扶正注射液的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4.3 劃痕實驗測定細胞遷移情況 細胞鋪滿單層后用小號槍頭垂直劃痕，加入無血清培養(yǎng)基，在體積分數(shù)5%CO2、37℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析。

1.4.4 Transwell實驗測定細胞侵襲情況 培養(yǎng)48 h后，將細胞消化成單細胞，并配成5×104個/mL濃度的不含血清的懸液。在用Matrigel包被的Transwell小室上室加入該細胞懸液，下室加入含有體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)。孵育24 h后，除去膜上層細胞，將通過膜侵襲的細胞固定染色，每組隨機選取5個視野，在顯微鏡下觀察。細胞侵入情況以每視野的平均細胞數(shù)表示。

1.4.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測細胞MMP2/β-actin、 p-c-Raf/c-Raf、 p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達水平 用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。以脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗（分別為MMP2 1∶500、β-actin 1∶1 000、 p-c-Raf 1∶1 000、 c-Raf 1∶1 000、p-MEK 1∶500、 MEK 1∶500 、 p-ERK 1∶1 000、ERK 1∶1 000稀釋）4℃過夜。再加入對應二抗室溫封閉1 h。TBST洗脫后，使用電化學發(fā)光（ECL）暗室曝光，X光片掃描，最后分析各條帶的灰度值。

1.5體內(nèi)實驗

1.5.1 移植瘤實驗 將40只裸鼠隨機分為空白對照組、參芪扶正高劑量組、MMP2高表達組、MMP2+參芪扶正組，每組10只。各組裸鼠于右后肢腹側(cè)分別皮下注射0.2 mL的1×107個/mL對應組別培養(yǎng)24 h的SCC-25細胞。同時，參芪扶正高劑量組和MMP2+參芪扶正組裸鼠每天給予癌旁注射40 mg·kg-1·d-1參芪扶正注射液，空白對照組和MMP2高表達組裸鼠每天給予癌旁注射等量生理鹽水1次，連續(xù)21 d。期間，各組裸鼠均于SPF條件下正常喂食。第21天給藥后頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，測定移植瘤體積，電子天平稱質(zhì)量。

1.5.2 免疫組織化學法檢測裸鼠移植瘤E-cadherin表達水平 裸鼠皮下移植瘤經(jīng)常規(guī)體積分數(shù)10%中性甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片，脫蠟水化。應用過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應。再分別加入鼠抗人E-cadherin抗體（1∶100稀釋），4℃過夜。然后，滴加生物素標記二抗，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明。最后，封片觀察統(tǒng)計。免疫組織化學陽性細胞胞質(zhì)為棕色著染，顯微鏡下隨機選取5個視野，每個視野陽性細胞比率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5.3 Western Blot法測定裸鼠移植瘤MMP2/β-actin、p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達水平 操作方法同“1.4.5”項。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，圖形使用GraphPad Prism 6.0構建。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（-x±s）表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，方差齊，2組比較采用t檢驗，檢驗標準為α=0.05（雙側(cè)），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度參芪扶正注射液的細胞毒性圖1結(jié)果顯示，0～40μg·mL-1參芪扶正注射液對SCC-25細胞的增殖活性無明顯毒性，50～80μg·mL-1參芪扶正注射液明顯降低口腔鱗狀細胞癌SCC-25細胞的增殖活性（P＜0.05）。因此，選擇參芪扶正注射液0～40μg·mL-1濃度進行后續(xù)實驗。

2.2參芪扶正注射液對SCC-25細胞遷移、侵襲及MMP2、c-Raf/MEK/ERK通路的影響圖2-A、-B結(jié)果顯示：與空白對照組比較，參芪扶正中、高劑量組和順鉑組細胞遷移率、每視野侵襲細胞個數(shù)均降低（P＜0.05或P＜0.01）。表明參芪扶正注射液可抑制SCC-25細胞遷移、侵襲。

圖1 不同濃度參芪扶正注射液的細胞毒性Figure 1 The cytotoxicity of different concentrations of Shenqi Fuzheng Injection

圖2-C結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪扶正中、高劑量組SCC-25細胞MMP2/β-actin蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而順鉑組SCC-25細胞MMP2/β-actin蛋白相對表達量無顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果表明，參芪扶正注射液可抑制SCC-25細胞MMP2蛋白的表達，作用優(yōu)于順鉑。

圖2-D結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪扶正中、高劑量組SCC-25細胞p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而順鉑組SCC-25細胞p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量無顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果表明，參芪扶正注射液可抑制SCC-25細胞c-Raf/MEK/ERK通路的激活，作用優(yōu)于順鉑。

2.3參芪扶正注射液對MMP2高表達SCC-25細胞侵襲、遷移及c-Raf/MEK/ERK通路的影響圖3-A、-B結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪扶正高劑量組細胞遷移率、每視野侵襲細胞數(shù)目顯著降低（P＜0.01），MMP2高表達組細胞遷移率、每視野侵襲細胞數(shù)目明顯增加（P＜0.05）；與MMP2高表達組比較，MMP2+參芪扶正組細胞遷移率、每視野侵襲細胞數(shù)目明顯減少（P＜0.01）。結(jié)果表明，參芪扶正注射液可通過抑制MMP2活性阻止SCC-25細胞遷移、侵襲。

圖2 參芪扶正注射液對SCC-25細胞遷移、侵襲及MMP2表達、c-Raf/MEK/ERK通路的影響Figure 2 The effects of Shenqi Fuzheng Injection on the migration，invasion，and MMP2 expression，c-Raf/MEK/ERK pathway in SCC-25 cells

圖3 參芪扶正注射液對MMP2高表達SCC-25細胞侵襲、遷移及c-Raf/MEK/ERK通路的影響Figure 3 The effects of Shenqi Fuzheng Injection on the migration，invasion，and c-Raf/MEK/ERK pathway in MMP2 over-expressed SCC-25 cells

圖3-C結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪扶正高劑量組SCC-25細胞p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01），MMP2高表達組p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與MMP2高表達組比較，MMP2+參芪扶正組細胞p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量明顯下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果表明參芪扶正注射液可通過抑制MMP2活性來阻止SCC-25細胞c-Raf/MEK/ERK通路的激活，從而限制OSCC轉(zhuǎn)移。

2.4參芪扶正注射液對裸鼠MMP2高表達移植瘤生長的影響圖4-A、-B、-C結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪扶正高劑量組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01），MMP2高表達組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量均明顯增加（P＜0.01）；與MMP2高表達組比較，MMP2+參芪扶正組移植瘤體積和質(zhì)量均明顯減少（P＜0.01）。

圖4-D結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪扶正高劑量組移植瘤E-cadherin陽性細胞所占比率顯著增多（P＜0.01），MMP2組移植瘤E-cadherin陽性細胞所占比率明顯減少（P＜0.01）；與MMP2高表達組比較，MMP2+參芪扶正組移植瘤E-cadherin陽性細胞所占比率明顯增加（P＜0.01）。

圖4-E結(jié)果顯示，與空白對照組比較，參芪扶正高劑量組移植瘤中MMP2/β-actin、p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量顯著下調(diào)（P＜ 0.01），MMP2組移植瘤中MMP2/β-actin、p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量明顯上調(diào)（P＜0.01）；與MMP2高表達組比較，MMP2+參芪扶正組移植瘤中MMP2/β-actin、p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.01）。

以上研究結(jié)果表明，參芪扶正注射液可能通過抑制細胞MMP2的活性阻止c-Raf/MEK/ERK通路的激活，從而控制OSCC移植瘤的生長。

圖4 參芪扶正注射液對裸鼠MMP2高表達移植瘤生長的影響Figure 4 The effects of Shenqi Fuzheng Injection on the growth of MMP2-overexpressed SCC-25 xenografts

3 討論

遠處轉(zhuǎn)移是口腔鱗狀細胞癌（OSCC）高復發(fā)率和預后差的主要原因。高侵襲能力和高遷移能力是腫瘤細胞高轉(zhuǎn)移能力的必要條件，抑制腫瘤細胞侵襲能力和遷移能力可有效地預防腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移通過一系列包括細胞外基質(zhì)的降解、細胞—細胞粘附、侵襲、遷移、血管生成和無限制細胞增殖的喪失等復雜事件發(fā)生[7]。有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）在細胞遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，主要降解細胞外基質(zhì)蛋白并參與信號轉(zhuǎn)導[8-9]。其在OSCC轉(zhuǎn)移病例中高表達，可促進OSCC細胞轉(zhuǎn)移[10-11]。本研究結(jié)果顯示，MMP2高表達使OSCC細胞遷移率、每視野侵襲細胞數(shù)目明顯增加，高劑量參芪扶正注射液可逆轉(zhuǎn)上述改變，表明參芪扶正注射液可通過抑制MMP2活性來阻止OSCC的轉(zhuǎn)移。

c-Raf/絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路是一條可被廣泛激活的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，能夠?qū)⒓毎庑盘杺鬟f入細胞核內(nèi)，其廣泛參與細胞的生長、增殖、分化、凋亡、侵襲和遷移等過程[12]，其失調(diào)與腫瘤的發(fā)病和惡性進展密切相關[13]。c-Raf可磷酸化激活MEK1和MEK2雙特異性蛋白激酶，而MEK1和MEK2反過來磷酸化激活ERK1和ERK2，激活的ERKs是細胞生理的多效性效應因子，在調(diào)控細胞分裂周期、細胞凋亡、細胞分化和細胞遷移的基因表達方面發(fā)揮重要作用[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，OSCC中c-Raf/MEK/ERK信號通路過度活化[14]。本研究結(jié)果顯示，MMP2高表達使OSCC細胞p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白表達升高，而參芪扶正注射液可逆轉(zhuǎn)上述改變，表明參芪扶正注射液可能通過抑制MMP2活性來阻止SCC-25細胞c-Raf/MEK/ERK通路的激活，從而限制OSCC轉(zhuǎn)移。

相比單一的外部環(huán)境，生物體內(nèi)環(huán)境是極其復雜多變的。本研究進行了裸鼠體內(nèi)MMP2高表達的移植瘤實驗，進一步探討了參芪扶正注射液對裸鼠MMP2高表達移植瘤生長的影響。E-cadherin的表達與惡性腫瘤的侵襲和遷移能力呈負相關，與預后呈正相關[15]，故E-cadherin的表達間接反映了腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，而高侵襲能力和高遷移能力是腫瘤細胞高轉(zhuǎn)移能力的必要條件。本研究結(jié)果顯示，MMP2高表達使OSCC裸鼠體內(nèi)移植瘤的質(zhì)量和體積明顯增加，移植瘤的E-cadherin陽性細胞比率降低，p-c-Raf/c-Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK蛋白表達明顯升高，而參芪扶正注射液可逆轉(zhuǎn)上述變化，表明參芪扶正注射液可能通過抑制細胞MMP2的活性阻止c-Raf/MEK/ERK通路的激活，從而控制OSCC移植瘤的生長。

綜上所述，參芪扶正注射液可抑制OSCC的轉(zhuǎn)移和發(fā)生發(fā)展，其機制可能與抑制OSCC細胞MMP2活性來阻止c-Raf/MEK/ERK信號通路激活有關。但具體分子機制還有待進一步深入研究。