柴胡皂苷A對糖尿病大鼠腎結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究

張曉利， 胡威利， 吳銀， 孫昆， 周一龍， 路芳

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，河南新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院血液凈化室，河南新鄉(xiāng) 453000）

長期處于高糖狀態(tài)下的腎臟損害是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，其腎功能往往損傷嚴(yán)重[1]，約30%的1型糖尿病將發(fā)展成終末期腎病[2]。因此，防治糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者的腎臟損害具有重要的研究意義。柴胡是常用傳統(tǒng)中藥材之一，味苦，性微寒，入肝膽經(jīng)，具有和解少陽、疏肝解郁、升陽的功效。其主要成分柴胡皂苷A（saikosaponin A）是一種具有多種藥理活性的三萜皂苷，具有保肝、護(hù)腎、抗炎、抗病毒、抗癲癇、抗抑郁、抗癌和抗氧化等作用[3-10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、高血糖、糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生和多種信號通路在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[11-13]?；诖?，本研究建立糖尿病大鼠和高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞模型，探討柴胡皂苷A對糖尿病模型大鼠的療效及保護(hù)其腎結(jié)構(gòu)和功能的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用柴胡皂苷A干預(yù)糖尿病腎病提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物50只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，購自北京維通利華公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2015-0001。于河南省新鄉(xiāng)市精神生物病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級別動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（豫）2014-0000。

1.2細(xì)胞大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E購自中國科學(xué)院。用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3藥物與試劑柴胡皂苷A（分子式：C42H68O13；分子量：780.98；純度：HPLC998%；批號：SS8020）購自北京索萊寶公司，經(jīng)二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成母液，-20℃避光保存。二甲雙胍（metformin），購自中國食品藥品檢定研究院。DMSO、蘇木素—伊紅（HE）染色試劑盒，購自北京索萊寶公司；胎牛血清、杜爾貝科改良培養(yǎng)基（Dulbecco’smodified Eagle’smedium，DMEM）、鏈脲佐菌素干粉，購自美國Sigma公司；TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒，購自美國ThermoFisher公司；血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、尿蛋白（UP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；兔源異檸檬酸脫氫酶2（IDH2）、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和沉默信息調(diào)節(jié)因子3（SIRT3）、GAPDH單克隆抗體及二抗，購自美國Abcam公司。

1.4主要儀器雅培安妥血糖儀及試紙（美國雅培公司）；PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（廣州云星儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；低溫離心機(jī)（美國IEC公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5動物實(shí)驗(yàn)

1.5.1 動物分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、柴胡皂苷A低劑量組（5 mg/kg）、柴胡皂苷A中劑量組（10 mg/kg）、柴胡皂苷A高劑量組（20 mg/kg）[14]和二甲雙胍組（350 mg/kg）[15]，每組6只。采用高脂喂食結(jié)合化學(xué)誘導(dǎo)法建立糖尿病大鼠模型[16-17]，方法：除正常組之外，其他各組大鼠分別喂食高脂飲食4周后，一次性腹腔注射用pH 4.5枸櫞酸緩沖液溶解配制成的鏈脲佐菌素（30 mg/kg）0.1 mL，構(gòu)建糖尿病大鼠模型；而正常組喂食普通飼料4周后，一次性腹腔注射0.1 mL枸櫞酸緩沖液。72 h后，大鼠尾靜脈空腹取血測定血糖值，血糖值若超過11.1 mmol/L則判斷造模成功，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。造模成功后，各給藥組分別對應(yīng)給予藥物灌胃，正常組和模型組給予等容量生理鹽水灌胃，每天給藥1次，連續(xù)28 d。

1.5.2 腎功能指標(biāo)24 hUP、SCr、BUN檢測 按照24 hUP、SCr、BUN測試盒說明方法，應(yīng)用可見分光光度計在595 nm波長處測24 hUP吸光度值，在546 nm波長處測SCr吸光度值，在640 nm波長處測BUN吸光度值。

1.5.3 腎臟肥大指數(shù) 稱取大鼠雙側(cè)腎質(zhì)量及體質(zhì)量計算腎臟肥大指數(shù)，腎臟肥大指數(shù)=雙腎質(zhì)量（m/mg）/體質(zhì)量（m/g）。

1.5.4 HE染色法觀察大鼠腎臟病理損傷情況 大鼠腎組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液充分固定，酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋后，制作成約4μm厚度的病理切片，再根據(jù)HE染色試劑盒說明書進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的病理變化。

1.5.5 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測腎臟組織氧化應(yīng)激因子SOD、GSH-Px活性及MDA含量 收取大鼠腎臟組織勻漿液上清，根據(jù)SOD、GSH-Px、MDA ELISA試劑盒說明書，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定SOD吸光度值，采用可見分光光度計于420 nm波長處測GSH吸光度值，于532 nm波長處測定MDA吸光度值。

1.5.6 逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA表達(dá) 用TRIzol試劑提取腎臟組織總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green PCRMaster試劑盒進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。72℃延長10 min。反應(yīng)結(jié)束后加做熔解曲線，以區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物及引物二聚體。根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線結(jié)果進(jìn)行PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。引物序列：IDH2（forward：5’-AATTAGCC CCGTCTG-3’； reverse：5’-GGGGAGAGAGAGA GACATTGAA-3’），擴(kuò)增片段長度為98 bp。MnSOD（forward：5’-AAGGAGCAGGTCTTAGCAGA-3’；reverse：5’-CAAATGGGCTAGTAGTCAGGTC-3’），擴(kuò)增片段長度為285 bp。SIRT3（forward：5’-GCT GACGACTTCGACGACG-3’；reverse：5’-TCGGT CAACAGGAGGTTGTCT-3’），擴(kuò)增片段長度為130 bp。

1.5.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3表達(dá) 用含蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解大鼠腎臟組織提取總蛋白，4℃離心收集上清，用二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉蛋白質(zhì)2 h后，分別加入IDH2、MnSOD、SIRT3、GAPDH等一抗（稀釋度為1∶800）4℃孵育過夜。棄去一抗，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。以化學(xué)發(fā)光法于暗室曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件統(tǒng)計灰度值，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示。

1.6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1 細(xì)胞模型 待NRK-52E細(xì)胞生長至融合狀態(tài)后，將細(xì)胞分為正常組、高糖組、柴胡皂苷A 5μmol/L組、柴胡皂苷A 10μmol/L組、柴胡皂苷A 20μmol/L組[18]。其中：正常組培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖，高糖組、柴胡皂苷A 5μmol/L組、柴胡皂苷A 10μmol/L組、柴胡皂苷A 20μmol/L組培養(yǎng)基含30 mmol/L葡萄糖[19]，分別刺激24 h。

1.6.2 ELISA法檢測細(xì)胞MDA、SOD、GSH-Px含量 收取各組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)液上清，具體檢測步驟同“1.5.5”項(xiàng)。

1.6.3 RT-PCR法檢測細(xì)胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA表達(dá) 用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，后續(xù)具體檢測步驟同“1.5.6”項(xiàng)。

1.6.4 Western Blot法檢測細(xì)胞IDH2、MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá) 用含蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解NRK-52E細(xì)胞提取總蛋白，后續(xù)具體操作步驟同“1.5.7”項(xiàng)。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數(shù)比較圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數(shù)均顯著增加（P＜0.01）。表明該糖尿病模型大鼠存在腎功能損害。與模型組比較，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數(shù)均下降（P＜0.05或P＜0.01），且3個治療組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A可有效減輕糖尿病大鼠腎功能損傷，并具有劑量依賴性。

圖1 各組糖尿病大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數(shù)比較（±s，N=6只）Figure 1 Comparison of the levels of 24 hUP，SCr and BUN，as well as renal mass index in various groups（±s，N=6）

2.2各組大鼠腎臟病理改變比較圖2結(jié)果顯示：正常組大鼠腎臟組織腎小球體積正常，未見系膜細(xì)胞增生，腎小管間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列緊密、胞漿豐富；模型組大鼠腎臟組織腎小球體積明顯增大，系膜基質(zhì)增多，腎小管腫脹、空泡樣變性，伴有炎性浸潤等；各給藥組大鼠腎組織病變均較模型組減輕，其中，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組僅見腎小管細(xì)胞輕度腫脹、空泡樣變性。

圖2 各組糖尿病大鼠腎臟病理改變比較（HE染色，×200；N=6只）Figure 2 Comparison of the rat renal pathological changes in various groups（by HEstaining method，×200；N=6）

2.3各組大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05或P＜0.01），且3個治療組大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A具有有效促進(jìn)糖尿病大鼠腎臟組織抗氧化酶活性、減少脂質(zhì)過氧化物生成進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，且呈劑量依賴性。

圖3 各組糖尿病大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px活性，MDA含量比較（±s，N=6只）Figure 3 Comparison of the activity of SOD and GSH-Px，and MDA content in rat renal tissue of various groups（±s，N=6）

圖4 各組糖尿病大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)比較（±s，N=6只）Figure 4 Comparison of the mRNA and protein expression levels of IDH2，MnSOD and SIRT3 in rat renal tissue of various groups（±s，N=6）

2.4各組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)比較圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05或P＜0.01），且3個治療組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A具有增強(qiáng)糖尿病大鼠腎臟組織抗氧化能力的作用，且呈劑量依賴性。

2.5各組大鼠NRK-52E細(xì)胞SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較圖5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組NRK-52E細(xì)胞SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A 10、20μmol/L組NRK-52E細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量減少（P＜0.05或P＜0.01）。表明柴胡皂苷A具有有效促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞抗氧化酶活性、減少脂質(zhì)過氧化物生成進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激損傷的作用，且呈劑量依賴性。

2.6各組大鼠NRK-52E細(xì)胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)比較圖6結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組NRK-52E細(xì)胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A 10、20 μmol/L組NRK-52E細(xì)胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。表明柴胡皂苷A具有增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞抗氧化能力的作用，且呈劑量依賴性。

3 討論

糖尿病腎病是一種嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥，主要病理變化表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率增加，伴隨腎小球肥大和硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化及系膜增生等病理改變，臨床上以持續(xù)的蛋白尿和腎功能進(jìn)行性下降為主要表現(xiàn)[20]。早期預(yù)防和治療十分必要。

圖5 各組NRK-52E細(xì)胞SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）Figure 5 Comparison of the activity of SOD and GSH-Px，and MDA content in NRK-52E cells of various groups（±s）

圖6 各組NRK-52E細(xì)胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Figure 6 Comparison of the mRNA and protein expression levels of IDH2，MnSOD and SIRT3 in NRK-52E cells of various groups（±s，n=3）

為觀察糖尿病大鼠腎結(jié)構(gòu)和功能變化，本研究采用高脂喂食結(jié)合化學(xué)誘導(dǎo)法構(gòu)建了糖尿病大鼠模型。結(jié)果顯示：模型組大鼠腎臟功能指標(biāo)24 hUP、SCr、BUN水平升高，腎臟肥大指數(shù)增加，腎臟組織可見腎小球體積明顯增大，系膜基質(zhì)增多，腎小管腫脹、空泡樣變性，伴有炎性浸潤等，表明糖尿病大鼠出現(xiàn)不同程度的腎結(jié)構(gòu)和功能損害。經(jīng)柴胡皂苷A干預(yù)后，糖尿病大鼠腎臟功能指標(biāo)24 hUP、SCr、BUN水平降低，腎臟肥大指數(shù)降低，受損的腎組織得到明顯改善。表明柴胡皂苷A可有效改善糖尿病大鼠腎臟病理損傷，從而調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的腎臟功能。

既往研究表明，氧化應(yīng)激是包括糖尿病在內(nèi)的多種慢性疾病及并發(fā)癥的機(jī)制之一[21-22]。Sirtuins是保守的III類組蛋白脫乙?；讣易?，SIRT3是該家族中調(diào)控細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過去乙?；せ畛趸锲缁?（SOD2）和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3（FOXO3）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷、減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的線粒體功能障礙[23-25]。IDH2和MnSOD是線粒體內(nèi)的抗氧化酶，SIRT3可作用于兩者，進(jìn)而打破細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）穩(wěn)定，SIRT3的表達(dá)缺失將直接導(dǎo)致活性氧簇蓄積，使葡萄糖攝入增加和線粒體氧化轉(zhuǎn)化[26-27]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠和高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞模型SOD和GSH-Px活性，IDH2、MnSOD和SIRT3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較正常組降低，MDA含量升高。柴胡皂苷A在糖尿病模型大鼠和高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞模型中上調(diào)IDH2、MnSOD和SIRT3的mRNA和蛋白表達(dá)，增加抗氧化酶（SOD和GSH-Px）活性、降低組織和細(xì)胞中氧化產(chǎn)物（MDA）的蓄積，從而改善糖尿病大鼠腎臟組織線粒體功能和高糖攝取，最終改善糖尿病大鼠的腎臟病理學(xué)改變和腎臟功能。

綜上所述，柴胡皂苷A可有效改善糖尿病大鼠腎結(jié)構(gòu)和功能損傷，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)高糖狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞的抗氧化能力、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。下一步我們將研究柴胡皂苷A對糖尿病腎病中抗氧化信號通路的調(diào)節(jié)作用。