姜黃素下調(diào)miR-21-5p減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡

謝瑾， 李紅， 羅浩

（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科，四川成都 610000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016）

心肌缺血再灌注損傷可導(dǎo)致心肌組織的嚴(yán)重?fù)p傷和功能障礙[1-3]。尋找用于防治心肌缺血再灌注損傷的有效藥物一直是研究的熱點。姜黃為姜科植物Curcuma longa L.的干燥根莖。性溫，味辛、苦。有破血行氣、通經(jīng)止痛的功效，用于治療胸脅刺痛、風(fēng)濕肩臂疼痛、跌打腫痛等病癥。姜黃素（curcumin）是從姜黃中提取的一種相對分子質(zhì)量小的多酚類物質(zhì)，通常認(rèn)為它是姜黃中最有效的成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎和降血脂等作用[4-7]。已有研究表明，姜黃素對缺血再灌注大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用[8]?；诖耍狙芯窟M(jìn)一步觀察姜黃素對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響，以期為開發(fā)和臨床應(yīng)用姜黃素治療心肌缺血再灌注損傷提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞株H9C2來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。實驗用細(xì)胞為處于對數(shù)生長期細(xì)胞。收集細(xì)胞時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化。

1.2藥物與試劑姜黃素，購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110823-201706?；瘜W(xué)式：C21H20O6；分子量：368.38；純度≥98.7%。Hoechst 33258染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑，均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青—鏈霉素，購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性測定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；熒光素酶檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；Bcl-2、Bax、caspase-3、GAPDH等抗體（美國Abcam公司）。

1.3儀器YKY-1200型熒光顯微鏡，購自上海永科光學(xué)儀器有限公司；Nanodrop?DR6000分光光度計，購自美國哈希公司；318C+酶標(biāo)儀，購自上海沛歐分析儀器有限公司；GT9611型PCR儀，購自杭州柏恒科技有限公司；SmartGel凝膠成像儀，購自天津賽歐斯科技有限公司。

1.4姜黃素對缺血/復(fù)氧心肌細(xì)胞的影響

1.4.1 細(xì)胞模型建立[9]及分組 將對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白對照組、缺氧/復(fù)氧組，姜黃素2.5、5、10μmol/L組[10]。除空白對照組外，其他各組用無糖DMEM培養(yǎng)基替換，置入體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%N2的培養(yǎng)室內(nèi)誘導(dǎo)缺氧4 h，再置于體積分?jǐn)?shù)95%空氣、5%CO2培育箱中復(fù)氧3 h，將無糖DMEM培養(yǎng)基替換回高糖培養(yǎng)基。姜黃素2.5、5、10μmol/L組于缺氧前在培養(yǎng)基中分別添加姜黃素2.5、5、10μmol/L，空白對照組、缺氧/復(fù)氧組不做其他處理。

1.4.2 MTT法測定細(xì)胞活力 H9C2細(xì)胞復(fù)氧培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞接種于96孔板（100μL/孔），每組設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入50μL MTT溶液，孵育4 h。吸出上清液，每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO），用平板搖床搖勻。用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測各孔光密度（OD，D）值。

1.4.3 LDH活性測定 H9C2細(xì)胞復(fù)氧培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書，測定LDH活性。

1.4.4 Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞凋亡 消化收集細(xì)胞，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定10 min或更長時間（可4℃過夜）。去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。去染色液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，亮藍(lán)色斑點密度代表細(xì)胞凋亡程度。

1.4.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧條件下Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平 將待測細(xì)胞用PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），100℃變性5 min。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。體積分?jǐn)?shù)5%BSA室溫封閉1～2 h。加入相應(yīng)的一抗（抗Bcl-2抗體：1∶1 000稀釋；抗Bax抗體：1∶1 000稀釋；抗caspase-3抗體：1∶1 000稀釋；抗GAPDH：1∶10 000稀釋），4℃過夜孵育。次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。清洗，加入發(fā)光液。應(yīng)用凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用Image J軟件測灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。至少重復(fù)3次。

1.4.6 逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧條件下miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平 用TRIzol試劑提取心肌細(xì)胞總RNA，用分光光度計測定總RNA的D260/D280，判定RNA純度，計算出總RNA的含量。按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成和PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增35個循環(huán)，72℃延長10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△Ct法計算miR-21-5p mRNA相對表達(dá)量。miR-21-5p上游引物序列為：5’-CGTTGA ATGTCACTCTGGTG-3’，下游引物序列為：5’-G GTCATTGTGTGCAGCTCAC-3’。Bcl-2上游引物序列為：5’-GGTGCCACCTGTGGTCCACCT-3’，下游引物序列為：5’-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3’。GAPDH上游引物序列為：5’-TGTGGGCATCA ATGGATTTGG-3’，下游引物序列為：5’-ACACC ATGTATTCCGGGTCAAT-3’。

1.5熒光素酶報告實驗檢測miR-21-5p與Bcl-2靶向關(guān)系通過TargetScan、mi Randa等靶基因預(yù)測軟件分析miR-21-5p和Bcl-2存在3’UTR的結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型的Bcl-2 3’UTR熒光素酶報告載體，分別命名為Bcl-2 wt和Bcl-2 mut。熒光素酶質(zhì)粒由Invitrogen公司設(shè)計合成。將H9C2細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞隨機(jī)分為4組，即Bcl-2 wt+空質(zhì)粒組、Bcl-2 wt+miR-21 mimic組、Bcl-2 mut+空質(zhì)粒組、Bcl-2 mut+miR-21 mimic組，每組設(shè)3個復(fù)孔。Bcl-2 wt+空質(zhì)粒組：將Bcl-2 wt和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞；Bcl-2 wt+miR-21 mimic組：將Bcl-2 wt和miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞；Bcl-2 mut+空質(zhì)粒組：將Bcl-2 mut和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞；Bcl-2 mut+miR-21 mimic組：將Bcl-2 mut和miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞。應(yīng)用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染48 h后，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞雙熒光素酶的活性。

1.6姜黃素對miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影響參照“1.4.1”項下方法，建立缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白對照組、姜黃素組、mimic組和姜黃素+mimic組。姜黃素組于缺氧前在培養(yǎng)基中添加姜黃素10μmol/L；mimic組轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic質(zhì)粒；姜黃素+mimic組于缺氧前在培養(yǎng)基中添加姜黃素10μmol/L并轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic質(zhì)粒。RT-PCR檢測miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平，Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7姜黃素對si-Bcl-2轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)及凋亡率的影響參照“1.4.1”項下方法，建立缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型并將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白對照組、姜黃素組、si-Bcl-2組和姜黃素+si-Bcl-2組。姜黃素組于缺氧前在培養(yǎng)基中添加姜黃素10μmol/L；si-Bcl-2組轉(zhuǎn)染si-Bcl-2質(zhì)粒；姜黃素+si-Bcl-2組于缺氧前在培養(yǎng)基中添加姜黃素10μmol/L并轉(zhuǎn)染si-Bcl-2質(zhì)粒。以Western Blot法檢測Bcl-2蛋白表達(dá)水平，Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.8統(tǒng)計方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1姜黃素對缺血/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞增殖活力及LDH活性的影響圖1結(jié)果顯示：與空白對照組比較，缺血/復(fù)氧組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01），LDH活性顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復(fù)氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組細(xì)胞活力均升高，LDH活性均降低，并具有劑量依賴性，且姜黃素5、10μmol/L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明姜黃素可促進(jìn)缺血/復(fù)氧心肌細(xì)胞的增殖活力，減輕細(xì)胞損傷。

圖1 姜黃素對缺血/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞增殖活力及LDH活性的影響Figure 1 The effect of curcumin on proliferative activity and LDH activity in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

圖2 姜黃素對缺血/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響Figure 2 The effect of curcumin on the apoptosis rate and expression of apoptosis-related proteins of caspase-3，Bax and Bcl-2 in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

2.2姜黃素對缺血/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的影響圖2-A、-B結(jié)果顯示：與空白對照組比較，缺血/復(fù)氧組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復(fù)氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組細(xì)胞凋亡率均降低，并呈劑量依賴性，且姜黃素5、10μmol/L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。圖2-C、-D結(jié)果顯示：與空白對照組比較，缺血/復(fù)氧組細(xì)胞caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與缺血/復(fù)氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），均呈劑量依賴性。表明姜黃素可抑制缺血/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡。

2.3姜黃素對缺血/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞miR-21-5p mRNA、Bcl-2 mRNA水平的影響圖3-A結(jié)果顯示：與空白對照組比較，缺血/復(fù)氧組miR-21-5p mRNA水平顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復(fù)氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組miR-21-5p mRNA水平均顯著降低，并呈劑量依賴性，且姜黃素5、10μmol/L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。圖3-B結(jié)果顯示：與空白對照組比較，缺血/復(fù)氧組Bcl-2 mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；與缺血/復(fù)氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組Bcl-2 mRNA水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。表明姜黃素可降低miR-21及抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)。

圖3 姜黃素對缺血/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞miR-21-5p mRNA、Bcl-2 mRNA水平的影響Figure 3 The effect of curcumin on the miR-21-5p mRNA and Bcl-2 mRNA expression in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

2.4 miR-21-5p與Bcl-2靶向關(guān)系搜索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得Bcl-2 3’UTR序列，結(jié)果如圖4-A所示。采用熒光素酶報告實驗驗證，如圖4-B結(jié)果顯示：Bcl-2 wt+miR-21 mimic組熒光素酶活性較Bcl-2 wt+空質(zhì)粒組、Bcl-2 mut+空質(zhì)粒組、Bcl-2 mut+miR-21 mimic組顯著降低（P＜0.01）。表明miR-21-5p和Bcl-2存在直接靶向作用關(guān)系。

圖4 miR-21-5p與Bcl-2靶向關(guān)系Figure 4 Targeting relationship between miR-21-5p and Bcl-2

2.5姜黃素對miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染后缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影響圖5-A、-B結(jié)果顯示：與缺血/復(fù)氧組比較，姜黃素組miR-21-5p mRNA水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復(fù)氧組比較，mimic組miR-21-5p mRNA水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；與mimic組比較，姜黃素10μmol/L+mimic組miR-21-5p mRNA水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平顯著升高（P＜0.01）。圖5-C結(jié)果顯示：姜黃素組細(xì)胞凋亡率顯著低于缺血/復(fù)氧組（P＜0.01），mimic組細(xì)胞凋亡率顯著高于缺血/復(fù)氧組（P＜0.01），姜黃素10μmol/L+mimic組細(xì)胞凋亡率顯著低于mimic組（P＜0.01）。表明姜黃素可靶向miR-21-5p抑制H9C2細(xì)胞凋亡。

圖5 姜黃素對miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染后缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影響Figure 5 The effect of curcumin on the mRNA expression levels of miR-21-5p and Bcl-2 and apoptosis rate in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes transfected with a mir-21-5p mimic

2.6姜黃素對si-Bcl-2誘導(dǎo)的缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)及凋亡率的影響圖6-A，-B結(jié)果顯示：姜黃素組Bcl-2蛋白水平較缺血/復(fù)氧組顯著升高（P＜0.01）；si-Bcl-2組Bcl-2蛋白水平較缺血/復(fù)氧組顯著降低（P＜0.01），si-Bcl-2組Bcl-2蛋白水平顯著低于姜黃素+si-Bcl-2組（P＜0.01）。圖6-C結(jié)果顯示：姜黃素組細(xì)胞凋亡率較缺血/復(fù)氧組顯著降低（P＜0.01），si-Bcl-2組細(xì)胞凋亡率較缺血/復(fù)氧組顯著升高（P＜0.01），姜黃素+si-Bcl-2組細(xì)胞凋亡率顯著低于si-Bcl-2組（P＜0.01）。表明姜黃素促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制si-Bcl-2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

圖6 姜黃素對si-Bcl-2誘導(dǎo)的缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)及凋亡率的影響Figure 6 The effect of curcumin on Bcl-2 protein expression and apoptosis rate in si-Bcl-2 transfected ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

3 討論

心肌缺血再灌注損傷后會發(fā)生4種類型的心功能障礙，包括無復(fù)流現(xiàn)象、心肌頓抑、再灌注心率失常和致死性再灌注損傷[11]。目前，對心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制有不同的解釋，如氧自由基理論[12]、鈣超載理論[13]和炎癥反應(yīng)理論[14]。已有研究表明，心肌缺血再灌注損傷過程中會發(fā)生凋亡，凋亡在心肌最終梗死區(qū)域起決定性作用[15]。當(dāng)使用特定藥物干預(yù)凋亡過程時，有效抑制凋亡可使心肌梗死面積達(dá)到70%，顯著改善心功能狀態(tài)[16]。因此，在臨床應(yīng)用抗凋亡藥物治療心肌缺血再灌注損傷具有重要意義。LDH是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一，在正常情況下，其不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)靶細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質(zhì)中。因此，檢測LDH活性變化可反映細(xì)胞損傷情況[17]。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞的細(xì)胞增殖活力降低，LDH活性增加，而姜黃素具有升高缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力，減輕細(xì)胞損傷的作用。

細(xì)胞凋亡也稱為程序性細(xì)胞死亡（PCD），而caspase-3是非常重要的起始因子[18]，其介導(dǎo)PCD過程。研究表明，caspase-3可以通過其自身的寡聚化切割而被激活，并且可以激活多種下游蛋白酶，并參與抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程[19]。下調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)可保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷[20]。誘導(dǎo)凋亡級聯(lián)的機(jī)制主要有內(nèi)在途徑和外在途徑，內(nèi)在凋亡途徑中的關(guān)鍵事件是線粒體外膜的透化，其響應(yīng)于各種刺激而發(fā)生，并且受若干細(xì)胞質(zhì)蛋白調(diào)節(jié)[21]。促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細(xì)胞質(zhì)，并在應(yīng)激下寡聚化，促進(jìn)線粒體釋放因子，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[22]。

Bcl-2基因在細(xì)胞存活和凋亡抑制中起關(guān)鍵作用[23]。臨床前研究表明，靶向抗凋亡Bcl-2家族成員的藥物具有臨床前活性[24]。抗細(xì)胞凋亡成員Bcl-2，可防止細(xì)胞凋亡。微小RNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其可以直接調(diào)控細(xì)胞中超過30%的基因[25]。miRNA還參與多種生物學(xué)過程，是細(xì)胞分化、生長、增殖和凋亡的主要調(diào)控因子[26]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21通過抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的自噬和細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防心肌缺氧/復(fù)氧損傷[27]。miRNA可通過靶向Bcl-2調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡[28-30]。

本研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡率及caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，姜黃素可下調(diào)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡率及caspase-3、Bax蛋白水平，上調(diào)Bcl-2蛋白水平。表明姜黃素可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡。

本研究通過生物信息預(yù)測和熒光素酶報告實驗證實miR-21-5p和Bcl-2兩者之間存在靶向關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞后miR-21-5p表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，凋亡率升高，而用姜黃素處理后miR-21-5p表達(dá)則降低，Bcl-2表達(dá)則升高，凋亡率降低，表明姜黃素可靶向miR-21-5p抑制H9C2細(xì)胞凋亡。通過構(gòu)建小干擾RNA干擾Bcl-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)姜黃素可升高Bcl-2表達(dá)，抑制si-Bcl-2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡。說明姜黃素可通過下調(diào)miR-21-5p表達(dá)解除對Bcl-2的抑制，進(jìn)而抑制H9C2細(xì)胞凋亡。

綜上所述，姜黃素靶向miR-21-5p抑制缺血/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，通過下調(diào)miR-21-5p表達(dá)解除對Bcl-2的抑制，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。