基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)歸腎丸治療卵巢早衰的作用機(jī)制

閆菲， 史云， 趙琦， 王曉梅， 蘇先芝， 劉一斐， 韓福國(guó)， 劉清飛

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；3.清華大學(xué)藥學(xué)院，北京 100084）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減弱甚至衰竭，以血清促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）與黃體生成素（luteinizing hormone，LH）濃度升高和雌二醇（estradiol-2，E2）濃度下降為特征的衰老性疾病[1]。近年來由于社會(huì)壓力增加、飲食生活習(xí)慣改變、環(huán)境污染等因素使得卵巢早衰的發(fā)病率逐漸升高并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其年發(fā)病率在1%～3%之間[2]。目前早發(fā)性卵巢功能不全臨床診療指南推薦卵巢早衰治療主要包括激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）、免疫抑制劑、卵巢凍存和移植、基因治療、干細(xì)胞移植、脫氫表雄酮（DHEA）等[3]。HRT可以維持年輕患者的第二性征，恢復(fù)月經(jīng)樣出血，但會(huì)增加高危人群卵巢癌、乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)[4]。促排卵可輔助生育，但易并發(fā)卵巢過度刺激，加速卵巢功能衰竭[5]。而干細(xì)胞治療、靶向基因治療、卵巢凍存和移植技術(shù)復(fù)雜，副作用暫不明確，多數(shù)尚處在評(píng)估安全性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段[6-9]。因此，在臨床中找到更有效治療卵巢早衰疾病的方法，延緩卵巢衰老病程是婦科學(xué)領(lǐng)域的重要研究問題。

中醫(yī)學(xué)無卵巢早衰病名，多將其歸屬“閉經(jīng)”“月經(jīng)量少”“年未老經(jīng)水?dāng)唷钡确懂?，腎虛是卵巢早衰發(fā)病的重要病因，肝郁脾虛、血瘀是次要病因病機(jī)。歸腎丸是《景岳全書》中的經(jīng)典方劑，由熟地黃、山茱萸、杜仲、當(dāng)歸、菟絲子、枸杞子、山藥、茯苓等8味中藥組成，藥味配伍精干練達(dá)，具有補(bǔ)陰益陽、養(yǎng)血填精的功效[10]。多項(xiàng)臨床研究證明歸腎丸能有效改善卵巢早衰患者潮熱、盜汗、月經(jīng)量少等癥狀[11-12]；相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，歸腎丸能顯著改善卵巢早衰模型大鼠卵泡功能[13-15]，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞也具有調(diào)整內(nèi)分泌、抑制凋亡等作用[16-17]。目前，歸腎丸治療卵巢早衰的主要活性成分及作用機(jī)制未見系統(tǒng)闡釋。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）是近年來發(fā)展起來的新興學(xué)科，它將中藥藥理學(xué)、高通量生物信息學(xué)、高端數(shù)據(jù)分析軟件高度整合，提出了“藥物—靶標(biāo)—病證”的中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究新理念，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、療效機(jī)理研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)[18]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)歸腎丸治療卵巢早衰的主要成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行挖掘，以期解釋其潛在的作用機(jī)制而為下一步研究指明方向，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1歸腎丸活性成分與潛在靶點(diǎn)篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）、中藥分子機(jī)制綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）檢索歸腎丸中各味藥材的全部化學(xué)成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為活性化合物的篩選條件，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)合并，建立歸腎丸化學(xué)成分—靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.2卵巢早衰疾病靶點(diǎn)篩選通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https：//www.omim.org/）、人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards，https：//www.genecards.org），以“premature ovarian failure”為關(guān)鍵詞檢索卵巢早衰的相關(guān)靶點(diǎn)，建立卵巢早衰疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。將成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集取交集，獲得歸腎丸—卵巢早衰疾病的共同靶點(diǎn)，并進(jìn)行藥物成分靶點(diǎn)—卵巢早衰疾病靶點(diǎn)映射，利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“活性成分—作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，藥物活性成分和作用靶點(diǎn)以“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示。

1.3蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將歸腎丸—卵巢早衰共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https：//string—db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以置信度分?jǐn)?shù)score≥0.700（高置信度）為條件進(jìn)行篩選，并隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，余參數(shù)不變，將得到的結(jié)果以文本形式導(dǎo)入CytoScape 3.6.1軟件中進(jìn)行可視化，獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4基因本體論（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)歸腎丸和卵巢早衰疾病共同作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO生物功能和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO生物功能分析主要用于描述基因靶點(diǎn)的功能，包括細(xì)胞功能、分子功能和生物功能3部分。KEGG富集分析可以得到歸腎丸和卵巢早衰疾病共同靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。GO和KEGG分析均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1歸腎丸活性成分與潛在靶點(diǎn)篩選通過在TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID平臺(tái)檢索，并將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果合并，共獲得歸腎丸活性成分162個(gè)，其中熟地黃2個(gè)，山藥18個(gè)，山茱萸23個(gè)，茯苓16個(gè)，當(dāng)歸6個(gè)，杜仲42個(gè)，枸杞子43個(gè)，菟絲子12個(gè)，共預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)829個(gè)。

2.2卵巢早衰疾病靶點(diǎn)篩選在OMIM、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)共得到與卵巢早衰疾病相關(guān)的靶點(diǎn)4 854個(gè)。將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，共得到AKT1、CASP3、CASP8、CASP9、FAS、EGF等152個(gè)共同靶點(diǎn)。

2.3“成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將歸腎丸活性成分與卵巢早衰關(guān)鍵靶基因及相關(guān)對(duì)應(yīng)關(guān)系以及屬性導(dǎo)入到CytoScape，建立“成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。使用CentiScape計(jì)算活性成分中心性（Degree Centrality，DC）。一個(gè)節(jié)點(diǎn)DC越大，說明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。DC結(jié)果槲皮素（quercetin）為88，豆甾醇（stigmasterol）為36，山萘酚（kaempferol）為33，β-胡蘿卜素（beta-carotene）為15，表兒茶素（ent-epicatechin）為14，分別位于前5位，見表1。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將152個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING中，選擇高置信度0.700，下載PPI.tsv文件導(dǎo)入到CytoScape，得到151個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)基因。其中TP53、AKT1、MMP9、ASP3、IL6位于核心基因位置。結(jié)果如圖2、3。

圖1歸腎丸治療卵巢早衰“化合物—靶點(diǎn)”圖Figure 1 “Component-target”network of Guishen Pills in treating POF

表1 歸腎丸活性成分以及OB、DL（DC數(shù)前10位）Table 1 Information of active ingredients in Guishen Pills and their OB，DL（top 10 DC）

圖2 歸腎丸治療卵巢早衰潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The interaction network of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

圖3 歸腎丸治療卵巢早衰前10位潛在靶標(biāo)的互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 The interaction network of top10 candidate targets from Guishen Pills in treating POF

2.5歸腎丸—卵巢早衰—基因的生物學(xué)過程根據(jù)顯著性程度P值由小到大進(jìn)行展示，GO分析結(jié)果提示歸腎丸—卵巢早衰—基因的生物過程（BP）顯著富集含氧化合物反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)；在分子功能（MF）主要富集在酶結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、分子功能監(jiān)管、相同蛋白結(jié)合、激酶結(jié)合上；細(xì)胞組分（CC）主要富集在細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、膜筏、膜區(qū)域上。見圖4～6。

2.6歸腎丸—卵巢早衰—基因的生物學(xué)通路KEGG富集分析得到富集后信號(hào)通路133條，刪除與“cancer”相關(guān)的通路，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，根據(jù)校正后P值進(jìn)行排序，篩選前30條進(jìn)行氣泡圖繪制。結(jié)果顯示，相關(guān)信號(hào)通路包括腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路、凋亡相關(guān)信號(hào)通路、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族（FoxO）信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。見圖7、8。富集前10位細(xì)節(jié)見表2。

圖4 歸腎丸治療卵巢早衰的潛在靶標(biāo)的BP分析Figure 4 Biological processes of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

圖5 歸腎丸治療卵巢早衰的潛在靶標(biāo)的CC分析Figure 5 Analysis for cellular components of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

圖6 歸腎丸治療卵巢早衰潛在靶標(biāo)的MF分析Figure 6 Analysis for molecular functions of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

3 討論

圖7 前30位KEGG通路富集氣泡圖Figure 7 Bubble map for top 30 KEGG pathways enrichment

圖8 歸腎丸治療卵巢早衰“成分—靶標(biāo)—通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Figure 8“Component-target-pathway”network of Guishen Pills in treating POF

3.1歸腎丸組方分析卵巢早衰的病因病機(jī)總以腎虛為主導(dǎo)，即所謂“經(jīng)水出諸腎”“腎水本虛，何能盈滿化經(jīng)水而外泄”。歸腎丸方中重用熟地黃以填精益髓，山茱萸、杜仲、當(dāng)歸滋陰養(yǎng)血促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，菟絲子、枸杞子溫陽益氣，促進(jìn)成熟卵泡排出，山藥、茯苓健脾培補(bǔ)后天以資先天。全方共奏補(bǔ)陰益陽、養(yǎng)血填精功效。

3.2歸腎丸活性成分分析通過分析得到歸腎丸治療卵巢早衰的活性成分有162個(gè)，包括槲皮素、大豆黃素、山萘酚、表兒茶素、豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇等。其中，槲皮素、大豆黃素、山萘酚是黃酮類化合物，具有很好的抗炎、抗氧化應(yīng)激等卵巢保護(hù)作用。有研究表明，槲皮素能夠增加自身免疫性卵巢早衰小鼠生長(zhǎng)卵泡和成熟卵泡的比例，降低自身免疫性卵巢炎[19]，還具有一定的促進(jìn)卵巢卵泡發(fā)育和成熟的作用而不影響卵巢壽命[20]。表兒茶素可以提高小鼠卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)及其發(fā)育潛能[21]。豆甾醇、谷甾醇均屬于植物甾醇，對(duì)去卵巢小鼠內(nèi)源激素不平衡狀況可以明顯改善，而β-谷甾醇可明顯促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌激素E2[22]。因此，可推測(cè)以上化合物是治療卵巢早衰的核心化合物。

表2 歸腎丸治療卵巢早衰KEGG通路富集前10位細(xì)節(jié)表Table 2 Data of top 10 KEGG pathways enrichment

3.3關(guān)鍵靶點(diǎn)分析通過對(duì)歸腎丸治療卵巢早衰的PPI網(wǎng)絡(luò)分析，其中AKT1、CASP3、MMP9、IL-6位于核心基因位置。AKT1是P13K/AKT信號(hào)通路的重要組成部分，在細(xì)胞生存和生長(zhǎng)調(diào)控中起到重要作用。研究表明，將AKT1從小鼠原代顆粒細(xì)胞中去除后從轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白組學(xué)中評(píng)估其分子后果，發(fā)現(xiàn)AKT1不僅在細(xì)胞新陳代謝、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)控中具有重要作用，在DNA修復(fù)、胞內(nèi)運(yùn)輸和線粒體功能上也有顯著改變[23]。CASP3是凋亡家族Caspase家族的明星蛋白，在卵巢生殖細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞中，CASP和Bcl2基因家族組成了促凋亡和抗凋亡易感基因[24]。卵泡閉鎖是導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備池過早衰竭的重要原因，而顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖所必須的，參與顆粒細(xì)胞凋亡的主要死亡受體配體系統(tǒng)是FAS和FASL系統(tǒng)，其后的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活Caspase 3導(dǎo)致DNA斷裂從而引起卵泡閉鎖[25]。MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族的重要組成成分，MMPs及其組織抑制劑（Timps）被廣泛認(rèn)為是卵巢細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的關(guān)鍵因子，在動(dòng)情周期中參與卵泡生長(zhǎng)、排卵、黃體化和黃體溶解[26]。有研究表明，通過qRT-PCR檢測(cè)出哺乳動(dòng)物的MMP9的mRNA在原始卵泡中含量最低，在早期卵泡中可檢測(cè)到峰值水平，而且在所有卵泡期的顆粒細(xì)胞中有特異性的高濃度的表達(dá)，說明MMPS家族，尤其是MMP9在卵泡腔的形成和擴(kuò)張中起到了重要作用[27]。女性排卵一直被認(rèn)為是復(fù)雜的炎癥反應(yīng)過程，卵巢內(nèi)或周圍的免疫細(xì)胞和促炎因子的改變都會(huì)對(duì)生殖功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[28]。IL-6屬于是典型的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子。研究表明，IL-6在體內(nèi)外均可以調(diào)節(jié)胎鼠生殖細(xì)胞的存活、增殖和分化，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-6及其受體在人類胎兒卵巢中表達(dá)，并在生殖細(xì)胞的多個(gè)成熟階段發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用[29]。

3.4歸腎丸治療卵巢早衰核心信號(hào)通路分析通過查閱文獻(xiàn)，KEGG富集結(jié)果中TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、凋亡相關(guān)信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等與卵巢早衰密切相關(guān)。卵巢排卵是一個(gè)復(fù)雜的生物過程[30]，而TNF信號(hào)通路是核心炎癥信號(hào)通路，TNF-α可通過發(fā)揮炎癥作用從而影響卵巢顆粒細(xì)胞通過自分泌和/或旁分泌機(jī)制來調(diào)節(jié)卵泡成熟和排卵[31]，在卵巢衰老[32]，顆粒細(xì)胞凋亡[33]、增殖[34]和分化[35]中均發(fā)揮重要作用。Fox是“Forkhead box”的縮寫，是根據(jù)在果蠅Fkh突變體中觀察到的異位頭結(jié)構(gòu)而命名的，是Fox蛋白轉(zhuǎn)錄因子的超家族，參與壽命、抗應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞增殖、分化和代謝等多種生命體過程，在卵巢功能中也發(fā)揮了強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用[36]。其亞家族中研究比較多的主要包括FoxO3、FoxO4、FoxO6。FoxO3是目前研究最多，與卵巢中卵泡激活與卵巢功能密切相關(guān)的，有研究表明，F(xiàn)oxO3表達(dá)和哺乳動(dòng)物的原始和初級(jí)卵泡密切相關(guān)[37]，當(dāng)FoxO3被調(diào)控，小鼠的生殖周期顯著延長(zhǎng)[38]。說明FoxO3蛋白可以作為一種調(diào)節(jié)因子，抑制原始卵泡的過度激活，增加卵巢儲(chǔ)備，從而延長(zhǎng)女性生育周期[39]。凋亡信號(hào)通路是當(dāng)前研究較為熱門的信號(hào)通路。Caspases家族如Caspase-3、Caspase-8是細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶家族的代表，有研究表明其作用與幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的起始和終末階段都有聯(lián)系，其他如Bcl2家族、cAMP家族、PI3K/AKT通路都與Caspases級(jí)聯(lián)蛋白水解活性相互作用，而其他幾種內(nèi)分泌和旁分泌調(diào)節(jié)分子也在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以抑制細(xì)胞凋亡[40]。PI3K/AKT信號(hào)通路是許多正常細(xì)胞過程（包括細(xì)胞增殖、存活、生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架重排和代謝）的關(guān)鍵調(diào)控因子[41]，越來越多的文獻(xiàn)證據(jù)證明，該通路是卵巢功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括原始卵泡的休眠和激活、卵母細(xì)胞的維持和激活及減數(shù)分裂以及顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的增殖和分化。各種因素導(dǎo)致的信號(hào)通路異常都可能導(dǎo)致原始卵泡耗竭從而導(dǎo)致不孕、卵巢早衰和原發(fā)性閉經(jīng)[42]。通路的中間蛋白可以通過抑制BAX、BAD、Forkhead、p53等促凋亡蛋白，激活Bcl2等抗凋亡蛋白，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活[43]，此外還可通過間接穩(wěn)定cyclingD1和Myc等蛋白調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展。

綜上所述，歸腎丸治療卵巢早衰的作用機(jī)制與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡等途徑相關(guān)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)依靠數(shù)據(jù)庫(kù)信息在理論層面進(jìn)行了初步探索，今后還需通過細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，目前的研究尚存在成分含量、相互作用以及體內(nèi)代謝過程等因素的影響，今后尚需對(duì)歸腎丸治療卵巢早衰功效的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以提高臨床用藥的合理性和科學(xué)性。