黃芪桂枝五物湯加味對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡的調(diào)節(jié)作用

陳俊曦， 黃東輝， 左曉暉， 陳舒， 冼小燕

（佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是個(gè)體接觸過(guò)敏原后，由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的多種免疫細(xì)胞和炎癥因子參與的鼻黏膜非感染性疾病，屬于I型變態(tài)反應(yīng)性疾病[1]。AR主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作噴嚏、流涕和鼻塞，嚴(yán)重影響患者的生活和工作。據(jù)調(diào)查，目前全世界約有5億AR患者，患病率為10%～25%，我國(guó)患病率為18%[2]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療AR主要以激素和抗組胺藥物治療為主，但副作用較明顯，且效果不甚理想。輔助性T（Thellper，Th）細(xì)胞Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡、嗜酸粒細(xì)胞（EOS）等在AR的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[3]。AR歸屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇，其病機(jī)主要為肺脾虛寒。黃芪桂枝五物湯具有益氣溫經(jīng)作用，本課題組在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯治療AR具有良好的療效，亦與多個(gè)研究報(bào)道結(jié)果一致[4-6]，但其機(jī)制尚不明確。因此，本研究觀察黃芪桂枝五物湯加味對(duì)AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康Wistar雌性大鼠60只，6～7周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)于佛山市中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%。

1.2藥物及制備黃芪桂枝五物湯加味方藥組成：黃芪20 g，桂枝15 g，芍藥15 g，大棗10 g，生姜10 g，辛夷15 g，五味子5 g。上述中藥飲片均由廣州致信藥業(yè)有限公司提供。每付中藥飲片加8倍量的水分別煎煮1.5 h和1 h，將2次藥液混合濃縮至2 g/mL，4℃保存。氯雷他定片（由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20171123），加生理鹽水配制成濃度為2 g/L的藥液。

1.3試劑與儀器卵白蛋白（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號(hào)：2017120354）；氫氧化鋁（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：2018023417）；黏蛋白5AC（MUC5AC）、黏蛋白5B（MUC5B）、IgE、組胺、白三烯酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；干擾素γ（IFN-γ）ELISA試劑盒（美國(guó)ScienCell公司）；白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10 ELISA試劑盒（德國(guó)PromoCell公司）。Multiskan Sky酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4動(dòng)物分組與模型構(gòu)建將60只大鼠隨機(jī)分為正常組（15只）和造模組（45只）。將造模組大鼠構(gòu)建AR模型，參照周柳青等[4]方法：①基礎(chǔ)致敏：卵白蛋白300 mg+氫氧化鋁30 mg+生理鹽水1 mL腹腔注射，隔日1次，共8次；②攻擊致敏：基礎(chǔ)致敏階段末次腹腔注射結(jié)束后，隔日開(kāi)始鼻內(nèi)激發(fā)階段。即2%卵白蛋白溶液滴入雙側(cè)鼻腔，每側(cè)0.05 mL，1次/d，共7次。正常組大鼠基礎(chǔ)致敏期間給予等體積的氫氧化鋁30 mg+生理鹽水1 mL腹腔注射，攻擊致敏期間給予生理鹽水雙側(cè)滴鼻。末次滴鼻30 min后觀察大鼠抓鼻、噴嚏、流涕癥狀，進(jìn)行鼻部癥狀評(píng)分，若總分＞5分，則判斷AR模型建立成功[7]。造模組有39只大鼠符合AR模型標(biāo)準(zhǔn)，然后將其隨機(jī)分為模型組（12只）、中藥組（14只）和氯雷他定組（13只）。

1.5給藥方法按照徐淑云主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人鼠藥物劑量換算公式[8]計(jì)算給藥劑量。造模結(jié)束后，中藥組給予黃芪桂枝五物湯加味10 g·kg-1·d-1灌胃，氯雷他定組給予氯雷他定生理鹽水溶液1.05 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，共28 d。

1.6鼻炎癥狀評(píng)分[7]觀察大鼠抓鼻、噴嚏、流涕癥狀。抓鼻（30 min次數(shù)）：1分（0～5次）、2分（6～9次）、3分（＞9次）；噴嚏（次/30 min）：1分（1～3次）、2分（4～9次）、3分（＞9次）；流涕：1分（流涕至鼻孔內(nèi)）、2分（流涕出鼻孔外）、3分（流涕滿面）。

1.7采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平所有大鼠末次灌胃結(jié)束后，禁食不禁水16 h，以100 g/L水合氯醛腹腔注射處死，輔助動(dòng)脈采血20 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，-70℃保存。血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10、MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯ELISA檢測(cè)方法的具體操作步驟按照各指標(biāo)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清50μL分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，然后加入50μL的標(biāo)記抗體，37℃溫育1 h。洗滌液清洗3次。每孔加入80μL的親和鏈酶素-HRP，37℃溫育30 min。洗滌液清洗3次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃溫育10 min，加入50μL終止液后，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（OD）值。

1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠鼻部癥狀評(píng)分的比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻部癥狀評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和氯雷他定組大鼠鼻部癥狀評(píng)分明顯降低（P＜0.05），且2個(gè)治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明黃芪桂枝五物湯加味可以改善AR大鼠的鼻炎癥狀。

表1 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻部癥狀評(píng)分的比較Table 1 Comparison of the scores of rhinitis symptoms in various groups （±s，s/分）

表1 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻部癥狀評(píng)分的比較Table 1 Comparison of the scores of rhinitis symptoms in various groups （±s，s/分）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組氯雷他定組鼻部癥狀評(píng)分0.42±0.02 6.54±1.04①1.34±0.24②1.15±0.16②N/只15 12 14 13

2.2各組大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平的比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和氯雷他定組大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平明顯降低（均P＜0.05），且2個(gè)治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明黃芪桂枝五物湯加味可降低AR大鼠引起噴嚏、流涕、鼻塞等癥狀的物質(zhì)含量，從而減輕鼻炎癥狀。

表2 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平的比較Table 2 Comparison of the levels of serum MUC5AC，MUC5B，IgE，histamine and leukotrienes in various groups （±s）

表2 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平的比較Table 2 Comparison of the levels of serum MUC5AC，MUC5B，IgE，histamine and leukotrienes in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組氯雷他定組白三烯[ρ/（ng·L-1）]32.34±9.57 56.27±9.56①39.21±8.32②36.12±7.24②N/只15 12 14 13 MUC5AC[ρ/（pg·mL-1）]26.35±3.24 56.87±7.13①32.16±6.32②29.84±4.28②MUC5B[ρ/（pg·mL-1）]31.27±5.43 67.28±8.73①36.54±6.57②39.72±5.46②IgE[ρ/（pg·mL-1）]21.36±6.57 43.21±9.25①24.69±5.17②26.21±4.68②組胺[ρ/（μg·L-1）]11.38±1.27 24.38±3.64①12.17±1.65②11.62±1.53②

2.3各組大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17水平明顯升高，IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯降低（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和氯雷他定組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17水平明顯降低，IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯升高（均P＜0.05），且2個(gè)治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明黃芪桂枝五物湯加味可調(diào)節(jié)AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡，抑制炎癥反應(yīng)，從而起到發(fā)揮治療AR的作用。

3 討論

有研究表明，Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡是變應(yīng)性鼻炎（AR）發(fā)生的2種重要機(jī)制[9]。Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在AR的發(fā)生發(fā)展中具有重要的意義。機(jī)體接觸變應(yīng)原后，經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞傳遞給Th細(xì)胞并分化為T(mén)h2細(xì)胞，Th2細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌IgE，聚集在鼻黏膜。當(dāng)變應(yīng)原再次進(jìn)入機(jī)體內(nèi)時(shí)，與IgE結(jié)合，引起肥大細(xì)胞釋放組胺、白三烯等物質(zhì)，促進(jìn)EOS浸潤(rùn)，釋放高毒性陽(yáng)離子蛋白，導(dǎo)致鼻黏膜上皮細(xì)胞損傷，引起毛細(xì)血管擴(kuò)張，同時(shí)促進(jìn)鼻黏膜腺體分泌MUC5AC、MUC5B黏液分泌過(guò)多，引起噴嚏、流涕、鼻塞等癥狀[10]。因此，MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯是導(dǎo)致AR大鼠出現(xiàn)噴嚏、流涕、鼻塞等癥狀的直接物質(zhì)基礎(chǔ)。IFN-γ和IL-2由Th1細(xì)胞分泌。IFN-γ可以抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4和抑制IgE合成，是IgE強(qiáng)抑制因子[11]；IL-2可促進(jìn)NK細(xì)胞增殖活化，抑制B細(xì)胞合成IgE[11]。IL-5和IL-4由Th2細(xì)胞分泌。IL-5可活化并促進(jìn)EOS浸潤(rùn)和釋放毒性蛋白，引起鼻黏膜腺體分泌、通透性增加[12]；IL-4可以活化B細(xì)胞，促進(jìn)IgE的合成，同時(shí)可以促進(jìn)EOS浸潤(rùn)[13]。IL-17由Th17細(xì)胞分泌，可促進(jìn)多種炎癥因子和趨化因子的合成，有較強(qiáng)的促炎作用[14]。IL-10由Treg細(xì)胞分泌，可抑制炎癥因子合成和抑制嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞釋放組胺、白三烯等物質(zhì)，減輕炎癥反應(yīng)[15]。因此，調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡是治療AR的重要途徑。

表3 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比較Table 3 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-17 and IL-10 in various groups[±s，ρ/（ng·mL-1）]

表3 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比較Table 3 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-17 and IL-10 in various groups[±s，ρ/（ng·mL-1）]

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組氯雷他定組IL-10 16.87±1.98 6.37±1.02①13.92±1.63②14.67±1.34②N/只15 12 14 13 IFN-γ 67.35±8.67 41.25±6.15①56.32±7.25②57.96±9.14②IL-2 6.87±1.03 3.06±0.69①6.15±1.13②6.62±1.24②IL-4 8.57±1.24 26.83±6.12①10.34±2.37②9.36±1.86②IL-5 2.63±0.15 4.67±0.39①2.78±0.41②2.86±0.34②IL-17 16.21±2.18 35.21±5.72①20.31±5.18②18.32±3.19②

AR屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇，病位在脾、肺二臟，肺脾虛損，肺氣虛寒，衛(wèi)表不固，腠理疏松，脾氣虛寒，化生不足，鼻竅失養(yǎng)，風(fēng)寒乘虛而入，邪聚鼻竅，發(fā)為鼻鼽[16-17]。鼻鼽總屬于本虛標(biāo)實(shí)之病，虛在脾肺虛寒，實(shí)在風(fēng)寒之邪。本研究所用的中藥方是在黃芪桂枝五物湯原方基礎(chǔ)上加辛夷、五味子而成，方中：黃芪補(bǔ)脾益肺，補(bǔ)在表之氣；桂枝溫陽(yáng)散寒；芍藥養(yǎng)血和營(yíng)，調(diào)和營(yíng)衛(wèi)；大棗養(yǎng)血益氣，助黃芪之功；生姜疏散風(fēng)寒；辛夷疏風(fēng)散寒，通塞利竅；五味子斂肺，防溫藥辛散太過(guò)。諸藥合用，共奏益氣溫陽(yáng)、宣通鼻竅之功。本研究采用卵白蛋白誘導(dǎo)大鼠AR模型，結(jié)果顯示與正常組比較，模型組大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯降低（P＜0.05），血清IL-4、IL-5、IL-17、MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平和鼻炎癥狀評(píng)分明顯升高（P＜0.05），提示成功建立大鼠AR模型，且AR大鼠存在Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡。究其病機(jī)，AR細(xì)胞免疫失衡與中醫(yī)正虛邪實(shí)具有高度相關(guān)性。介導(dǎo)保護(hù)性免疫的Th1和Treg細(xì)胞可以抑制炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)免疫功能，而促炎的Th2和Th17細(xì)胞可以加重炎癥，引發(fā)AR。因此，當(dāng)體外環(huán)境因素作用于機(jī)體導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)，導(dǎo)致Th1和Treg細(xì)胞活性減弱，IFN-γ、IL-2、IL-10分泌減少（相當(dāng)于“正虛”），Th2和Th17細(xì)胞分化增多，IL-4、IL-5、IL-17分泌增加，造成MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯等病理產(chǎn)物聚集鼻竅（相當(dāng)于“邪實(shí)”），發(fā)為鼻鼽。經(jīng)干預(yù)后，與模型組比較，中藥組大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯升高（P＜0.05），血清IL-4、IL-5、IL-17、MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平和鼻炎癥狀評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。提示黃芪桂枝五物湯加味可調(diào)節(jié)AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡，抑制炎性分子正常產(chǎn)生，降低炎性反應(yīng)程度，得以“扶正祛邪”，從而改善AR的癥狀。

綜上所述，黃芪桂枝五物湯加味可改善AR大鼠鼻炎癥狀，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡有關(guān)。