慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠海馬興奮-抑制平衡和認(rèn)知功能的影響☆

牛偉盼 張?jiān)?王瀚 李繼濤 司天梅 蘇允愛(ài)○☆

慢性應(yīng)激是抑郁癥的重要誘發(fā)因素，慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激模型是研究抑郁癥病理機(jī)制的有力工具[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，成年期的慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激可引起嚙齒類(lèi)動(dòng)物大腦結(jié)構(gòu)和功能改變，導(dǎo)致認(rèn)知功能損害[2]。但是慢性應(yīng)激引起認(rèn)知功能損害的機(jī)制尚不清楚。近年研究強(qiáng)調(diào)，大腦內(nèi)由谷氨酸和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）介導(dǎo)的興奮-抑制神經(jīng)傳遞平衡是大腦可塑性形成和維持的重要基礎(chǔ)[3]。如果這個(gè)平衡被打破則會(huì)誘發(fā)包括抑郁癥等多種神經(jīng)精神疾病[4-5]，而這種興奮-抑制失衡是否參與慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激誘發(fā)的認(rèn)知功能損害，尚沒(méi)有研究。海馬是產(chǎn)生和調(diào)節(jié)情緒、動(dòng)機(jī)及調(diào)控學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的關(guān)鍵腦區(qū)，同時(shí)也是對(duì)應(yīng)激敏感的腦區(qū)之一[6]。因此本研究旨在觀(guān)察慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠依賴(lài)海馬的認(rèn)知功能和對(duì)海馬興奮-抑制平衡的影響，探討應(yīng)激相關(guān)認(rèn)知功能障礙及MDD的分子病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年8周齡C57BL/6N雄性小鼠（n=20）和成年雄性退役 CD1 小鼠（n=25，21 只用于造模，4只用于社交回避實(shí)驗(yàn)）購(gòu)自北京維通利華公司。C57小鼠按體重隨機(jī)分為應(yīng)激組（n=10）與對(duì)照組（n=10）。本研究所有操作獲得北京大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 建立慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激模型 參考WAGNER等[7]慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激模型的實(shí)驗(yàn)范式。雄性CD1小鼠（體重40 g以上）單籠飼養(yǎng)2周以上，并篩選出具有強(qiáng)攻擊性（發(fā)起攻擊的潛伏期＜30 s）的小鼠用于造模。過(guò)程如下：每日將應(yīng)激組小鼠放入陌生CD1小鼠的飼養(yǎng)籠中，發(fā)生攻擊行為后，將C57小鼠繼續(xù)暴露于CD1小鼠30 s，隨后將C57與CD1小鼠用金屬孔板隔開(kāi)，使2只小鼠保持視覺(jué)、嗅覺(jué)等接觸，但避免軀體接觸。C57小鼠每天面對(duì)不同的攻擊鼠，應(yīng)激持續(xù)21 d。每日評(píng)估應(yīng)激組小鼠是否發(fā)生嚴(yán)重的軀體損害，如有發(fā)生予以剔除。對(duì)照組小鼠按照正常條件單籠飼養(yǎng)。

1.3 社交回避實(shí)驗(yàn) 采用該實(shí)驗(yàn)考察應(yīng)激是否導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)社交回避等抑郁樣行為，評(píng)估模型的表面效度。測(cè)試分為兩個(gè)階段：熟悉階段，在實(shí)驗(yàn)箱側(cè)壁中央放入一個(gè)空筆筒，將筆筒周?chē)?0 cm×25 cm的區(qū)域設(shè)置為實(shí)驗(yàn)小鼠和CD1小鼠的互動(dòng)區(qū)域，視頻跟蹤實(shí)驗(yàn)小鼠2.5 min；互動(dòng)階段，將1只陌生CD1小鼠放入筆筒，視頻跟蹤2.5 min，考察實(shí)驗(yàn)鼠與CD1小鼠的互動(dòng)時(shí)間。計(jì)算實(shí)驗(yàn)鼠互動(dòng)期與熟悉期在互動(dòng)區(qū)域逗留的時(shí)間比值作為社交指數(shù)。如果社交指數(shù)大于1，提示小鼠具有社交互動(dòng)行為。

1.4 空間物體辨別實(shí)驗(yàn) 利用小鼠對(duì)新位置物體好奇的生物習(xí)性來(lái)評(píng)估小鼠對(duì)物體空間位置信息的記憶能力，考察應(yīng)激是否損害小鼠依賴(lài)海馬的認(rèn)知行為。測(cè)試分為熟悉期和辨別期：熟悉期時(shí)，在測(cè)試箱內(nèi)放入兩個(gè)相同鋁制正方體，小鼠熟悉物體，視頻跟蹤10 min；間隔60 min后進(jìn)入辨別測(cè)試期，改變其中一個(gè)物體的位置，放入小鼠，視頻跟蹤10 min。采用偏愛(ài)指數(shù)反映小鼠的再認(rèn)記憶能力，即探索新位置物體時(shí)間占探索兩個(gè)物體總時(shí)間的比值。

1.5 免疫組化染色 采用免疫組化法檢測(cè)小鼠海馬囊泡性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1）、囊泡性 γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（vesicular GABA transporter，VGAT）、 小 清 蛋 白（parvalbumin，PV）表達(dá)量及小清蛋白陽(yáng)性中間神經(jīng)元 （parvalbumin positive interneurons，PVIs） 密 度 。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，每組隨機(jī)取5只小鼠，進(jìn)行麻醉、灌注、取腦。采用連續(xù)冠狀切片，厚度為30 μm。選取包含前囟點(diǎn)向后1.46～2.18 mm的范圍，腦片之間間隔180 μm。采用漂片法進(jìn)行免疫組化染色，分別加入兔源VGLUT 1（1:10000,Synaptic Systems， 德 國(guó) ）、VGAT （1:500，Synaptic Systems，德國(guó)）、PV（1:20000，SWANT,瑞士）在 4 ℃下孵育24 h。次日與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（中杉金橋，中國(guó)）室溫孵育90 min，完成DAB顯色和脫水透明封片。運(yùn)用ImageJ軟件分析海馬不同亞區(qū)目的蛋白平均光密度值及計(jì)算PVIs密度。每只小鼠每個(gè)亞區(qū)結(jié)果為3～4個(gè)完整腦片的平均結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。小鼠社交指數(shù)不符合正態(tài)分布，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。探索物體時(shí)間、海馬中目的蛋白表達(dá)量及PVIs密度等為正態(tài)分布，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同一組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 社交互動(dòng)行為與空間物體辨別記憶

2.1.1 社交回避實(shí)驗(yàn) 應(yīng)激組小鼠的社交互動(dòng)行為減少，社交指數(shù)均小于1，且低于對(duì)照組（Z=3.19，P＜0.01，表 1）。

2.1.2 空間物體辨別實(shí)驗(yàn) 在辨別期，對(duì)照組小鼠探索新位置物體的時(shí)間比值高于舊位置物體（t=3.68，P＜0.01）；而應(yīng)激組小鼠對(duì)新、舊位置物體的探索時(shí)間比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.10，P=0.95）。應(yīng)激組的偏愛(ài)指數(shù)低于對(duì)照組（t=2.38，P＜0.01，表 1）。 兩組小鼠探索新舊位置物體的總時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.86，P=0.64，表 1）。

2.2 海馬突觸水平上興奮-抑制平衡

2.2.1 VGLUT1表達(dá)量 應(yīng)激組海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）VGLUT1 表達(dá)量低于對(duì)照組 （t=3.78，P＜0.01），而應(yīng)激組與對(duì)照組小鼠 CA1 區(qū)（t=1.77，P=0.11）和 CA3 區(qū)（t=1.36，P=0.21）VGLUT1表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1，表2）。

2.2.2 VGAT表達(dá)量 應(yīng)激組海馬CA3區(qū)VGAT表達(dá)量低于對(duì)照組（t=3.78，P＜0.01），而應(yīng)激組與對(duì)照組 CA1（t=0.94，P=0.38）和 DG 區(qū)（t=0.84，P=0.42）VGAT表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2，表2）。

2.2.3 VGLUT1/VGAT比值 應(yīng)激組海馬CA3區(qū)VGLUT1/VGAT的比值高于對(duì)照組 （t=5.21，P＜0.01），而應(yīng)激組與對(duì)照組 CA1（t=1.58，P=0.15）和DG 區(qū)（t=0.46，P=0.66）的 VGLUT1/VGAT 比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

2.3 海馬PV蛋白表達(dá)量及PVIs密度

2.3.1 PV蛋白表達(dá)量 應(yīng)激組海馬DG區(qū) （t=3.25，P=0.01）與 CA3 區(qū)（t=4.09，P＜0.01）PV 蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，而應(yīng)激組與對(duì)照組CA1區(qū)（t=0.33，P=0.75）的PV蛋白表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3，表 3）。

2.3.2 PVIs密度 應(yīng)激組海馬 DG區(qū) （t=3.61，P=0.05）和 CA3 區(qū)（t=6.20，P＜0.01）PVIs密度低于對(duì)照組，DG區(qū)和CA3區(qū)分別降低約36.2%與25.8%，而應(yīng)激組與對(duì)照組CA1區(qū) （t=0.61，P=0.11）PVIs密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 3，表 3）。

3 討論

表1 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠社交互動(dòng)行為及空間物體辨別記憶的影響

本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)3周慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)社交回避行為，提示應(yīng)激組小鼠存在抑郁樣行為，表明該模型可以在一定程度上模擬MDD。在空間物體辨別任務(wù)中，對(duì)照組小鼠探索新位置物體的時(shí)間比值高于舊位置物體，提示小鼠對(duì)新位置物體有偏好；應(yīng)激組小鼠對(duì)新位置物體的探索時(shí)間比值與對(duì)舊位置物體的探索時(shí)間比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示其不能辨別出新、舊位置的物體。此外，應(yīng)激組的偏愛(ài)指數(shù)低于對(duì)照組，表明慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激損害小鼠對(duì)空間物體位置的辨別能力，破壞了依賴(lài)海馬的認(rèn)知行為。本研究發(fā)現(xiàn)慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激可引起小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為與依賴(lài)海馬的認(rèn)知功能損害，與既往研究結(jié)果一致[8-9]。

表2 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠海馬突觸水平上興奮-抑制平衡的影響

圖1 應(yīng)激組和對(duì)照組海馬區(qū)VGLUT1免疫組化染色圖例 海馬冠狀切片圖標(biāo)尺=200μm，亞區(qū)圖標(biāo)尺=50μm

圖2 應(yīng)激組和對(duì)照組海馬區(qū)VGAT免疫組化染色圖例 海馬冠狀切片圖標(biāo)尺=200μm，亞區(qū)圖標(biāo)尺=50μm

表3 慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)海馬PV表達(dá)量及PVIs密度的影響

圖3 應(yīng)激組合對(duì)照組海馬區(qū)PV蛋白免疫組化染色圖例 海馬冠狀切片圖標(biāo)尺=200μm，亞區(qū)圖標(biāo)尺=50μm

在神經(jīng)生物學(xué)水平上，本研究關(guān)注大腦興奮性與抑制性突觸的特異性標(biāo)記物VGLUT1和VGAT。它們分別位于興奮性和抑制性突觸囊泡中，特異性地裝載谷氨酸或GABA進(jìn)入突觸囊泡并促進(jìn)其釋放入突觸間隙，并通過(guò)影響囊泡充盈程度和數(shù)量，對(duì)興奮/抑制神經(jīng)傳遞平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激降低DG區(qū)VGLUT1和CA3區(qū)VGAT表達(dá)水平，升高CA3區(qū)VGLUT1/VGAT比值，提示海馬區(qū)出現(xiàn)突觸水平上的興奮-抑制失衡，呈現(xiàn)過(guò)度興奮狀態(tài)。這與既往研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果相一致，如GAO等[12]與VAN DER KOOIJ等[13]均發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激引起大鼠海馬腦區(qū)興奮-抑制平衡改變，其海馬呈興奮狀態(tài)。

為進(jìn)一步研究這種失衡是否與抑制性中間神經(jīng)元有關(guān)，本研究聚焦于PVIs。PVIs是研究最多的抑制性中間神經(jīng)元之一，它表達(dá)特異性鈣結(jié)合蛋白——PV，并具有快放電的特性。它在維持正常興奮-抑制平衡和高頻神經(jīng)元同步化活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激下調(diào)DG和CA3區(qū)PV蛋白表達(dá)水平及PVIs的密度，提示海馬區(qū)突觸水平上的興奮-抑制失衡可能與PVIs下調(diào)有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，慢性輕度應(yīng)激、隔離應(yīng)激、束縛應(yīng)激均可減少大鼠海馬所有亞區(qū)PVIs的數(shù)量[15-17]。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)小鼠海馬DG和CA3區(qū)PV蛋白表達(dá)水平及PVIs密度下降，與文獻(xiàn)結(jié)果不完全一致，這可能與研究使用的應(yīng)激范式及動(dòng)物種系不同有關(guān)。

本研究從基礎(chǔ)研究的角度提示海馬區(qū)興奮-抑制失衡可能參與應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害。這有助于進(jìn)一步理解應(yīng)激相關(guān)認(rèn)知損害及MDD的病理機(jī)制，為今后的MDD藥物治療開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究用VGLUT1/VGAT比值和PVIs密度改變來(lái)反映海馬興奮-抑制失衡具有一定的局限性，今后研究可利用電生理技術(shù)檢測(cè)興奮性或抑制性神經(jīng)元的功能來(lái)直接反映興奮-抑制平衡的變化。此外，由于本研究中神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的樣本量較少，未能對(duì)行為與分子改變進(jìn)行相關(guān)分析，今后需對(duì)兩者之間的關(guān)系做進(jìn)一步研究。