骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件液對水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

張 俊，自永宏，李嬌嬌，陸鳳花，石德順

（廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院／亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004）

卵母細(xì)胞體外成熟是進(jìn)行體外胚胎生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前卵母細(xì)胞體外成熟與體內(nèi)成熟相比存在成熟率低和發(fā)育能力差等諸多問題，極大地阻礙了卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的廣泛應(yīng)用。為完善卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)、進(jìn)一步提高體外成熟質(zhì)量，研究人員進(jìn)行了諸多嘗試，特別是在細(xì)胞共培養(yǎng)方面［1］。卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟是在卵泡內(nèi)進(jìn)行的，卵泡細(xì)胞（包括顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞）對卵母細(xì)胞成熟有重要影響［2］。近年來，越來越多的研究集中于卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)對卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育潛力的影響［3－5］。但將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow－derived mesenchymal stem cells，BMSC）共培養(yǎng)用于卵母細(xì)胞體外成熟的研究目前較少，特別是在水牛上尚未見報(bào)道。

BMSC是源自中胚層的干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、抗擊炎癥、營養(yǎng)作用、自我更新以及多胚層分化潛能等功能，被作為理想種子細(xì)胞用于組織工程、細(xì)胞移植、基因治療和器官移植等領(lǐng)域［6－10］。在臨床上BMSC可用于治療各類疾病，主要通過分泌細(xì)胞因子進(jìn)行營養(yǎng)支持、免疫調(diào)節(jié)和改善微環(huán)境［11］。然而BMSC用于卵母細(xì)胞體外成熟和卵泡發(fā)育的研究報(bào)道相對較少，迄今僅見小鼠BMSC條件液有利于小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的報(bào)道［12］，BMSC與腔前卵泡共培養(yǎng)能提高人腔前卵泡的發(fā)育能力［13］，但在大動物上仍未有研究報(bào)道。為此，本試驗(yàn)首次嘗試探討B(tài)MSC條件液對水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響，主要通過卵母細(xì)胞體外成熟率和早期孤雌胚胎發(fā)育能力的測定，以期通過導(dǎo)入BMSC的分泌因子進(jìn)一步完善水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑來源及配制

組織培養(yǎng)液（tissue culture medium 199，TCM199）、胎牛血清（foetal bovine serum，F(xiàn)BS），均購自美國Gibco公司；其他試劑如無特別說明均購自美國Sigma公司。

清洗液（cleaning medium，CCM 液）：TCM199＋5 mmol／L NaHCO3＋5 mmol／L Hepes＋3% 發(fā)情牛血清（oestrous cow serum，OCS）；成熟液（maturation medium，M 液）：TCM199 ＋26.2 mmol／L NaHCO3＋5 mmol／L Hepes＋5% OCS＋0.1μg／mL促卵泡素（FSH）；胚胎培養(yǎng)液（embryo culture medium，CM 液）：TCM199＋26.2 mmol／L NaHCO3＋5 mmol／L Hepes＋5% OCS；離子霉素溶液（Ionomycin）：CM液＋5μmol／L離子霉素；6－DMAP溶液：CM液＋2 mmol／L 6－DMAP；CCM液、M液和CM液均添加60 mg／L青霉素和100 mg／L鏈霉素，并用0.22μm微孔濾膜過濾器除菌。

1.2 水牛卵母細(xì)胞的收集

從南寧市屠宰廠收集中國沼澤型水牛卵巢，放置在盛有37℃生理鹽水的保溫瓶中，確保2～3 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。用眼科剪刀將卵巢周圍的脂肪組織去除，用一次性12號10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡的卵泡液，將卵泡液置于60 mm玻璃皿中，在體式顯微鏡下揀出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，COCs），用CCM液清洗干凈，放入裝有1.5 mL M 液的玻璃皿中進(jìn)行成熟，注意只選取卵丘細(xì)胞層完整和胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 水牛BMSC的分離培養(yǎng)

選取體長10～18 cm水牛胎兒，用生理鹽水清洗，用無菌剪刀和鑷子剝?nèi)ニＬ核闹L骨，盡量去除長骨表面所黏附軟骨、肌肉和筋膜等組織。用雙抗磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗已分離干凈的長骨，去除長骨兩端部分骨垢，用1 mL注射器吸取已預(yù)熱到37℃的原代細(xì)胞培養(yǎng)基（低糖DMEM ＋10% FBS），用注射器針頭輕輕插入一段骨垢，沖洗骨垢和骨髓腔，反復(fù)沖洗直至流出液體變清亮為止，收集沖洗液。

將收集的沖洗液用孔徑40μm的細(xì)胞篩過濾，收集到離心管中，1 200 r／min離心5 min。棄去上清液后用PBS重懸清洗細(xì)胞，再離心，棄去上清液。最后用原代培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，均勻接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。此過程盡量避免晃動，24 h后吸取并棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，更換新鮮原代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)基，原代培養(yǎng)時間一般為5～7 d。待原代細(xì)胞生長至80%匯合度，按照1∶3比例對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 水牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件液的收集

選取第1～3代生長狀態(tài)良好的水牛BMSC，傳至12孔板的5個孔中，確保每孔細(xì)胞匯合度至少達(dá)70%。從傳代接種開始計(jì)時，每24 h收集一個孔的培養(yǎng)基，如此連續(xù)收集4 d，收集的液體為1～4 d骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件液（BMCM conditioned medium，BMCM）。在進(jìn)行BMCM收集期間，每孔細(xì)胞均不更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5 水牛卵母細(xì)胞的體外成熟以及孤雌激活

收集的水牛COCs清洗干凈后，置于放有1.5 mL M液的玻璃皿中，在5% CO2、38.5℃培養(yǎng)箱中成熟24 h。卵母細(xì)胞成熟后，用吸管反復(fù)抽打，盡可能吹掉卵母細(xì)胞周圍擴(kuò)展的卵丘細(xì)胞，然后對成熟好的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活。

卵母細(xì)胞體外成熟22～24 h，吹掉卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞，用CM液清洗3遍，用5μmol／L離子霉素溶液激活5 min，在含有2 mmol／L 6－DMAP的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h，再用CM液清洗3次，移至含有黃牛卵丘細(xì)胞單層的微滴培養(yǎng)盤中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察記錄卵裂數(shù)和發(fā)育囊胚數(shù)。

1.6 水牛卵母細(xì)胞體外成熟率和早期胚胎發(fā)育潛力的評定

卵母細(xì)胞體外成熟24 h后，吹掉卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞，在體式顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞第一極體排出情況。卵母細(xì)胞孤雌激活后，移至有黃牛卵丘單層細(xì)胞的微滴培養(yǎng)盤中，24 h后統(tǒng)計(jì)分裂數(shù)，5～8 d后記錄統(tǒng)計(jì)囊胚數(shù)，以孤雌激活后發(fā)育的卵裂率和囊胚率評定早期胚胎的發(fā)育潛力。孤雌激活后使用底部鋪有黃牛卵丘單層細(xì)胞的微滴培養(yǎng)盤。該培養(yǎng)盤需在使用前2 d制備，培養(yǎng)胚胎時注意每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)1：主要探討成熟培養(yǎng)液中添加不同收集天數(shù)BMCM對水牛卵母細(xì)胞體外成熟及早期孤雌胚胎發(fā)育的影響。將同一批次水牛COCs分別在添加不同收集天數(shù)（1，2，3，4 d）BMCM（各組添加比例均為10%）的成熟液中進(jìn)行24 h的體外成熟，觀察卵母細(xì)胞成熟率（第一極體排出率）。然后將卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，觀察早期胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎卵裂率和囊胚率。對照組只添加成熟液。

試驗(yàn)2：主要探討成熟培養(yǎng)液中添加不同比例BMCM對水牛卵母細(xì)胞體外成熟以及早期孤雌胚胎發(fā)育的影響。將同一批次水牛COCs分別在不同添加比例（5%、10%、20%、40%）BMCM（各組收集天數(shù)均為3 d）的成熟液中進(jìn)行24 h的體外成熟，觀察卵母細(xì)胞成熟率（第一極體排出率）。然后將卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，觀察早期胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎卵裂率和囊胚率。對照組只添加成熟液。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并分析差異顯著性，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，每個試驗(yàn)至少進(jìn)行5次生物學(xué)重復(fù)（n＝5），即同一試驗(yàn)處理中用相互獨(dú)立的水牛卵母細(xì)胞至少進(jìn)行5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛BMSC的細(xì)胞形態(tài)

見圖1。

圖1 顯微鏡下水牛BMSC（第0～3代）

2.2 成熟培養(yǎng)液中添加不同收集天數(shù)BMCM對水牛卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響

見表1和表2。

表1 添加不同收集天數(shù)BMCM 后水牛卵母細(xì)胞體外成熟率測定結(jié)果

表2 添加不同收集天數(shù)BMCM 后水牛卵母細(xì)胞體外成熟早期胚胎發(fā)育指標(biāo)測定結(jié)果

由表1可以看出，與對照組相比，2 d BMCM組和3 d BMCM 組成熟率顯著提高（P＜0.05），且3 d BMCM組成熟率最高。說明BMCM的適宜收集時間為2 d或3 d，且3 d最為適宜。

由表2可以看出，與對照組相比，2 d BMCM組和3 d BMCM組水牛卵母細(xì)胞卵裂率與囊胚率均顯著高于對照組（P＜0.05），且3 d BMCM組卵裂率和囊胚率最高。說明收集3 d BMCM添加到成熟液中最有利于水牛卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育。

2.3 成熟培養(yǎng)液中添加不同比例BMCM對水牛卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響

見表3和表4。

表3 添加不同比例BMCM 后對水牛卵母細(xì)胞體外成熟率測定結(jié)果

表4 添加不同比例BMCM 后水牛卵母細(xì)胞體外成熟早期胚胎發(fā)育指標(biāo)測定結(jié)果

由表3可以看出，與對照組相比，5%、10%、20% BMCM 組成熟率顯著提高（P＜0.05），且10% BMCM組成熟率最高。說明BMCM添加比例以10%為宜。

由表4可以看出，5%、10%、20% BMCM組水牛卵母細(xì)胞卵裂率與囊胚率均顯著高于對照組（P＜0.05），且10% BMCM組卵裂率和囊胚率最高。說明收集10% BMCM添加到成熟液中最有利于水牛卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育。

3 討論

卵母細(xì)胞成熟是卵母細(xì)胞逐步獲得恢復(fù)減數(shù)分裂能力和為早期胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備的過程，因而卵母細(xì)胞體外成熟效果可直接影響卵母細(xì)胞后續(xù)受精和發(fā)育的能力。要使卵母細(xì)胞獲得好的成熟效果，不僅細(xì)胞核要成熟，而且細(xì)胞質(zhì)也要同步成熟。目前卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)中存在的主要問題是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟不同步的問題，卵母細(xì)胞在體外環(huán)境解除了減數(shù)分裂的阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞核先成熟、細(xì)胞質(zhì)后成熟現(xiàn)象，核質(zhì)成熟不同步導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量、受精能力和胚胎發(fā)育能力差等問題［14－15］。

本試驗(yàn)首次嘗試在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加BMCM，探討是否有助于解決水牛卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量差、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟不同步的問題。在小鼠上已有研究報(bào)道，使用BMSC條件液能提高小鼠卵母細(xì)胞腔前卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)胚胎的發(fā)育［12］。同時在人上的研究表明，BMSC與腔前卵泡共培養(yǎng)能提高人腔前卵泡的體外發(fā)育能力（包括卵泡存活率、生長速度和生存能力）［13］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BMCM能提高水牛卵母細(xì)胞體外成熟率和早期胚胎發(fā)育潛力，說明BMCM添加于水牛卵母細(xì)胞體外成熟液中不僅能促進(jìn)細(xì)胞核的成熟，而且促進(jìn)了細(xì)胞質(zhì)的成熟，從而有利于水牛卵母細(xì)胞體外成熟核質(zhì)成熟的同步。本試驗(yàn)結(jié)果與BMCM對小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的效果基本一致。BMSC有助于卵母細(xì)胞的體外成熟，找到BMCM的最適收集時間點(diǎn)和最適添加比例至關(guān)重要，這與牛顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞條件液作用于卵母細(xì)胞體外成熟研究的結(jié)果大致相符［2］。

目前BMSC應(yīng)用于疾病治療相關(guān)方面的研究成為熱點(diǎn)，特別是在BMSC具有免疫特性、能分泌多種生長因子、改善局部微環(huán)境等方面的研究。本試驗(yàn)嘗試使用BMSC作用于水牛卵母細(xì)胞體外成熟，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高卵母細(xì)胞體外成熟能力，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究中，將水牛BMCM添加到卵母細(xì)胞成熟液中促進(jìn)了卵母細(xì)胞核質(zhì)的同步成熟，推測BMSC分泌生物活性因子（特別是生長因子），提高了卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂能力。但水牛BMSC究竟分泌哪些生長因子以及具體是某種或某些生長因子在發(fā)揮作用，目前仍然未知，這也是今后需要具體探討的內(nèi)容。相信伴隨蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)越來越發(fā)揮舉足輕重的作用，BMSC作用于卵母細(xì)胞體外成熟的調(diào)控機(jī)制有望被盡快解析。

4 結(jié)論

添加收集3 d的10%BMCM有利于水牛卵母細(xì)胞的體外成熟及隨后胚胎早期發(fā)育潛能的獲得。