支持細(xì)胞中雄激素受體信號傳導(dǎo)的研究進(jìn)展

王子銘，馬銘鈞，黃富碩，馮 瑞

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

支持細(xì)胞（sertoli）作為眾多體細(xì)胞中有且僅有的一種能與生精細(xì)胞產(chǎn)生聯(lián)系的細(xì)胞，所擁有的緊密連接結(jié)構(gòu)在雄性生殖過程中非常重要，可以維持和調(diào)節(jié)部分睪丸免疫功能，為生精細(xì)胞提供足夠的雄性激素，同時(shí)為精子發(fā)生提供營養(yǎng)和能量。在雄性生殖過程當(dāng)中，支持細(xì)胞對眾多生殖細(xì)胞來說有著像“保姆”一樣的功能，故稱之“保姆細(xì)胞”。雄激素作為重要的一類生殖激素可以參與到支持細(xì)胞的生理活動(dòng)中。雄激素受體（androgen receptor，AR）是雄激素發(fā)揮作用的重要中間物質(zhì)，而支持細(xì)胞內(nèi)的雄激素受體參與到眾多生理活動(dòng)，主要有保持血睪屏障（blood－testis barrier，BTB）的完整性、對生精細(xì)胞的減數(shù)分裂起到支持、參與生精細(xì)胞的黏附以及釋放精子等作用。

AR本身屬于類固醇激素核受體超家族，在眾多家族成員中有5個(gè)屬于脊柱動(dòng)物，包括雄激素受體、雌激素受體（estogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptors，GR）和鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）［1］。AR可以在有雄激素作用的組織（如前列腺、骨骼肌、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2］）中較好地表達(dá)；也可以被內(nèi)源雄激素激活，包括睪酮（testosterone）和5α－雙氫睪酮（5αhihydrotestosterone，DHT）。

1 AR的結(jié)構(gòu)

AR基因位于X染色體Xq11～Xq12位點(diǎn)。這個(gè)蛋白被2 757個(gè)核苷酸編碼，是由919個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為110 kDa的復(fù)合物。共分成4個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域：氨基端結(jié)構(gòu)域、脫氧核糖核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Hinge結(jié)構(gòu)域、羧基端配體結(jié)構(gòu)域［1］。雄激素受體功能準(zhǔn)確發(fā)揮作用是依靠各個(gè)結(jié)構(gòu)域的完整性來實(shí)現(xiàn)的。

1.1 氨基端結(jié)構(gòu)域

該結(jié)構(gòu)域由第1～555位氨基酸組成。有多聚谷氨酰胺和多聚甘氨酸序列兩個(gè)重復(fù)的序列包含在其中［3－5］。研究表明，多聚谷氨酰胺長度對雄激素受體蛋白的折疊有影響并且參與調(diào)控AR氨基端的結(jié)構(gòu)［6］。AR的活性與多聚谷氨酰胺序列反復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)有關(guān)，即多聚谷氨酰胺序列反復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)減少可以在很大程度上提高AR活性，而AR活性的削弱是由多聚谷氨酰胺序列反復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)增加造成的。

1.2 脫氧核糖核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域

該結(jié)構(gòu)域由第556～624位氨基酸組成。這個(gè)結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)：第一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)包含一個(gè)P－BOXCAR（第577～581位氨基酸，GSCKV）序列，介入辨認(rèn)DNA，聯(lián)合特異性的應(yīng)答元件；第二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)包括1個(gè)D－BOXAR（第596～600位氨基酸，ASRND），直接參與AR復(fù)合物的形成，有利于AR與脫氧核糖核酸相融合。

1.3 Hinge結(jié)構(gòu)域

該結(jié)構(gòu)域由第625～688位氨基酸構(gòu)成，包含AR的入核序列。介入到AR入核的調(diào)控中，同時(shí)Hinge具備主要的磷酸化、乙酞化位點(diǎn)，介入AR轉(zhuǎn)錄后修飾。

1.4 羧基端配體結(jié)構(gòu)域

該結(jié)構(gòu)域亦稱配體結(jié)構(gòu)域（ligand binding domain，LBD），由第669～919位氨基酸構(gòu)成。羧基端結(jié)構(gòu)域由12個(gè)α－螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)參與組成，是高度保守的，參加辨認(rèn)雄激素，同時(shí)與蛋白穩(wěn)定性相關(guān)。研究表明，這個(gè)結(jié)構(gòu)域帶有肌動(dòng)蛋白的結(jié)合基因序列，可與微管結(jié)合進(jìn)而介導(dǎo)AR的核轉(zhuǎn)移［7］。

AR的氨基端結(jié)構(gòu)域是最易變的，而脫氧核糖核苷酸結(jié)構(gòu)域是甾體激素核受體家族不同成員間最保守的結(jié)構(gòu)域，所有甾體激素核受體的脫氧核糖核苷酸結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成。這些鋅指結(jié)構(gòu)有促進(jìn)AR與調(diào)節(jié)AR的基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域脫氧核糖核苷酸結(jié)合的功能，從而以氨基端結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合域的激活功能來刺激或抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。在甾類激素核受體家族中高度保守的脫氧核糖核苷酸結(jié)構(gòu)域選擇性地與雄激素反應(yīng)元素相結(jié)合，激活特定的AR，配體結(jié)合域在核轉(zhuǎn)錄因子之間也有十分相似的結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)AR和熱休克以及伴侶蛋白之間的相互作用，同時(shí)也與AR的氨基端相互作用以穩(wěn)定結(jié)合雄激素。

2 AR與生殖障礙

雖然AR參與多種活動(dòng)，但其主要功能與男性生理有關(guān)，如性別分化和性別特異性疾病。AR基因缺陷會導(dǎo)致雄性第二性征發(fā)育停止，并導(dǎo)致雄激素不敏感綜合征，即體內(nèi)細(xì)胞對雄激素的部分無應(yīng)答或完全無應(yīng)答。AR基因缺陷可由四種類型的突變（單點(diǎn)突變導(dǎo)致替換或過早終止密碼子、核苷酸嵌入和丟失造成的突變、基因完全或部分缺失和影響AR基因RNA剪接的內(nèi)含子突變）引起。目前，在人類AR基因中已發(fā)現(xiàn)1 029個(gè)不同的突變，主要分布在AR脫氧核糖核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和羧基端配體結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)域。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肯尼迪病（也稱為脊髓球性肌萎縮癥）與AR中多聚谷氨酰胺序列的重復(fù)性有關(guān)，這是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病。AR與乳腺癌、喉癌、肝癌和睪丸癌等癌癥的關(guān)系成為當(dāng)下研究的主要方向。

3 AR細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)

在沒有配體反應(yīng)的情況下，AR是無活性的，并且通過結(jié)構(gòu)域與微管的相互作用而位于細(xì)胞質(zhì)中。在雄激素的介入下，AR很快與配體相聯(lián)系，發(fā)生構(gòu)象變化，然后被與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的細(xì)胞間蛋白識別，介導(dǎo)AR轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜和細(xì)胞核［8－9］。目前對AR核運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制基本上已明了。小于40 kD的低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)進(jìn)行主動(dòng)運(yùn)輸，依靠輸入蛋白質(zhì)家族的成員進(jìn)行介導(dǎo)。包括AR在內(nèi)的甾體類受體成員都被認(rèn)為是經(jīng)輸入蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制開展運(yùn)輸。AR的hinge結(jié)構(gòu)域具有經(jīng)典入核序列信號（NLS），雄激素作用下AR發(fā)生構(gòu)象改變，暴露其入核序列［10］。研究發(fā)現(xiàn)，除了importinα和importinβ在AR入核中起重要作用外，微管也參與AR的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)［11］，干擾微管的穩(wěn)定性可以干擾AR的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)。這表明AR的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移需要微管功能的完整性。AR通過與動(dòng)力蛋白相互作用，依賴于動(dòng)力蛋白的功能快速向微管的負(fù)極移動(dòng)，即近細(xì)胞核端，進(jìn)而誘導(dǎo)AR在細(xì)胞核周圍富集，更高效地與importinα和importinβ結(jié)合，完成快速入核。

4 支持細(xì)胞中AR的信號傳導(dǎo)

AR在作為配體的睪酮作用下，在支持細(xì)胞中參與精子發(fā)生的四個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，即減數(shù)分裂、維持溴麝香草酚藍(lán)（BTB）、支持細(xì)胞與生精細(xì)胞的黏附以及精子的釋放。在沒有支持細(xì)胞AR的小鼠中，通常在減數(shù)分裂的粗線期或者雙線期精子發(fā)生進(jìn)程就停止了。在小鼠等嚙齒動(dòng)物中，AR含量通常在VⅡ～ⅥQ期達(dá)到最大峰值。在此期間，支持細(xì)胞中的AR介入了BTB的分解和重建。當(dāng)沒有雄激素刺激AR時(shí)，兩種血睪屏障結(jié)構(gòu)性蛋白（caveolin－1和Rab11）處于較低濃度狀態(tài)，這就導(dǎo)致血睪屏障難以長時(shí)間維持下去［12］。支持細(xì)胞中的AR缺失可能導(dǎo)致生殖細(xì)胞處于異常狀態(tài)，導(dǎo)致未成熟的生精細(xì)胞從支持細(xì)胞中過早解離。因?yàn)檫@種大量未成熟的生精細(xì)胞過早解離的堆積，導(dǎo)致成熟精子無法在Ⅷ期釋放，最終被當(dāng)成異常物質(zhì)被支持細(xì)胞所吸收［13］。支持細(xì)胞中的AR主要通過兩條信號通路發(fā)揮作用，一條是經(jīng)典信號通路，一條是非經(jīng)典信號通路。

4.1 經(jīng)典信號通路及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白

正常狀態(tài)下支持細(xì)胞胞質(zhì)中的AR是與熱體克蛋白結(jié)合的，自由擴(kuò)散的睪酮與AR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，接下來導(dǎo)致AR結(jié)構(gòu)改變并且同時(shí)與熱體克蛋白分離。在細(xì)胞質(zhì)中游離出的AR再次被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與DNA上的雄激素反應(yīng)原件（androgen response elements，AREs）聯(lián)合，接下來與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄翻譯，這是經(jīng)典途經(jīng)，耗時(shí)較長。調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄需要0.5 h，而蛋白翻譯過程還需要花費(fèi)數(shù)倍的時(shí)間［14］。但是AR還有一種快速方式彌補(bǔ)經(jīng)典途徑消耗的時(shí)間。在AR經(jīng)典信號通路中，與不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合就可以調(diào)控AR的不同功能以及活性AR。在活化狀態(tài)下，即當(dāng)AR與激動(dòng)劑聯(lián)合時(shí)AR募集活化劑以增加其轉(zhuǎn)錄活性，包括類固醇類激素受體共調(diào)節(jié)因子（CREB結(jié)合蛋白、p300和p300／CBP結(jié)合因子等），進(jìn)而協(xié)助完成高效轉(zhuǎn)錄［15］。在抑制狀態(tài)下，即AR與頡頏劑聯(lián)合時(shí)，AR會招募視黃酸和甲狀腺激素受體沉默介質(zhì)［16－17］、組蛋白去乙酞化酶等，削弱轉(zhuǎn)錄AR活性。

4.2 非經(jīng)典途徑

目前AR的非經(jīng)典途徑有兩條方式被廣泛關(guān)注，一條是由鈣離子內(nèi)流引起的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，另一條是MAP磷酸化級聯(lián)反應(yīng)。

支持細(xì)胞中某些相關(guān)酶和物質(zhì)可以影響基因的轉(zhuǎn)錄，E.Gorczynska等［18］在1995年發(fā)現(xiàn)，在支持細(xì)胞內(nèi)睪酮量增加會導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生Ca2＋內(nèi)流現(xiàn)象。磷脂酶C是一個(gè)依靠位于細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體與睪酮結(jié)合而被激活的酶，而細(xì)胞之間PIP2可以被磷脂酶C水解為IP，并生成二鄰苯二甲酸甘油（DAG）。PIP2在被消耗后會引起K＋ATP通道開放?？梢詫IP2看作是K＋ATP通道的抑制劑。同時(shí)支持細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生去極化。由于去極化而引起的細(xì)胞外膜電壓的變化導(dǎo)致L型Ca2＋通道開放和大量Ca2＋進(jìn)入［19］。以上這些支持細(xì)胞中的PIP2、磷脂酶C、Ca2＋流入量和DAG的變化都影響基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對分泌生精細(xì)胞必需營養(yǎng)物、支持細(xì)胞與生精細(xì)胞鏈接、生精細(xì)胞的移動(dòng)產(chǎn)生影響［20］。AR一樣也可以通過一種耗時(shí)短的信號傳導(dǎo)途徑傳遞雄激素信號。由于AR中有一段多脯氨酸排列的區(qū)域可以使它與Src激酶的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該區(qū)域通過某種未知的細(xì)胞間途徑磷酸化Src激酶激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）［21］。由于細(xì)胞膜上有豐富的Src激酶，這個(gè)反應(yīng)通常發(fā)生在細(xì)胞膜上。但是由于AR廣泛在細(xì)胞中存在，那么直接參與催化其磷酸化的AR是細(xì)胞膜附近的還是錨定在細(xì)胞膜上的，還有待研究。研究者在蛋白免疫印跡試驗(yàn)和共聚焦熒光顯微鏡觀察中，都曾在細(xì)胞膜發(fā)現(xiàn)可以特定結(jié)合的AR［22］。EGFR磷酸化是MAP磷酸級聯(lián)反應(yīng)（Raf、MEK、ERK激酶）激活的前提，MAP磷酸化級聯(lián)反應(yīng)被激活后，ERK激酶就會導(dǎo)致p90Rsk磷酸化，隨后激活CRE結(jié)合蛋白（CAMP response element binding protein，CREB）。在睪丸支持細(xì)胞中，CREB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的Ldha、Egr1、Creb等基因［23］在睪酮作用后表達(dá)增加。但是這三個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域并不缺少ARE結(jié)構(gòu)，這可以證明是一個(gè)非經(jīng)典的雄激素途徑指導(dǎo)完成活動(dòng)。M.Scobey等［24］用含有缺陷的CREB腺病毒感染大鼠睪丸支持細(xì)胞，結(jié)果顯示，處理組單倍體精細(xì)胞數(shù)量比正常組減少了四分之三。這表明在維持生精過程中CREB蛋白的活化也很重要。

4.3 PI3K／AKT通路

PI3K／AKT途徑觸及多種細(xì)胞進(jìn)程，包含細(xì)胞生長和存活，并且是生長和發(fā)育的重要信號途徑之一，被認(rèn)為是控制細(xì)胞增殖、分化和存活的關(guān)鍵所在。AR還可以通過非基因組途徑激活A(yù)KT，使用PI3K抑制劑可以抑制這種作用。AR的氨基端結(jié)構(gòu)域可以在雄激素的催化下與Src聯(lián)系，激活PI3K的p85a，直接激活PI3K。PI3K活化后AR與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85a的親和力上升，同時(shí)產(chǎn)生3，4－二磷酸磷脂酞肌醇和3，4，5－三磷酸磷脂酞肌醇。p85a與SH2亞基域連系以誘發(fā)AKT活化。Akt在PIP2的催化下生成均聚體，并達(dá)到部分活化狀態(tài)。在PIP3和PH結(jié)構(gòu)域的幫助下，Akt與細(xì)胞膜相關(guān)聯(lián)并錨定在細(xì)胞膜上。同時(shí)，二聚體進(jìn)一步增強(qiáng)Akt活性。Akt與細(xì)胞膜分離，使其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步激活下游信號級聯(lián)，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的普遍功能。Akt是PI3K信號通路里最重要的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，可以誘導(dǎo)下游分子（如GSK3p、PFK－2、mTOR、Bad，F(xiàn)orkhead等）變成有轉(zhuǎn)錄活性的狀態(tài)。AR在PI3K－AKT信號通路中以這類方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，同時(shí)對細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制。在LNCaP細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，AKT在雄激素作用的很短時(shí)間內(nèi)被快速地激活，而AR在PC3（陰性AR細(xì)胞）中表達(dá)，并且還檢測到快速AKT激活［25－26］。說明AKT激活是經(jīng)由非基因組功能實(shí)現(xiàn)的。對AKT和AR之間相互作用的分析研究表明，AKT和AR的結(jié)合出現(xiàn)在漿細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)中。干擾AR的漿細(xì)胞膜轉(zhuǎn)染抑制了AR與AKT之間的相互作用，也抑制了AKT的激活［25］，說明了AR從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移過程中的變化對于PI3K－AKT通路的重要意義。

5 討論

乙?；?、泛素化、磷酸化、甲基化、棕櫚?；蛃umo修飾這些常見的轉(zhuǎn)錄后修飾也通常出現(xiàn)在AR的轉(zhuǎn)錄過程中。而AR在這些轉(zhuǎn)錄后的變化也影響受體自身功能的實(shí)現(xiàn)。在AR的核轉(zhuǎn)移過程中可以發(fā)生磷酸化修飾，可以促進(jìn)激活靶基因和其他生物學(xué)功能［27］。乙?；揎椏梢源龠M(jìn)AR的核轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖［28］。

不僅僅是AR可以與雄激素結(jié)合并作用于支持細(xì)胞，還有其他種類的受體也有同樣的作用。1995年E.Gorczynska等［18］發(fā)現(xiàn)，用睪酮處理支持細(xì)胞會出現(xiàn)一種短時(shí)間內(nèi)鈣離子內(nèi)流的現(xiàn)象。Gq型蛋白受體可以與睪酮結(jié)合，在支持細(xì)胞的細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了它的存在，它可以激活磷脂酶C74。細(xì)胞內(nèi)PIP2被磷脂酶C 水解為IP，產(chǎn)生二甘醇（DAG）。PIP2作為一種K＋ATP通道的抑制劑，當(dāng)生理活動(dòng)需要消耗PIP2時(shí)，使支持細(xì)胞上的K＋ATP通道打開，并使支持細(xì)胞去極化。Ca2＋依賴性通道的開放以及隨后出現(xiàn)的大量Ca2＋內(nèi)流是去極化所引起的外膜電位變化引起的。對體內(nèi)支持細(xì)胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響的原因有很多，PIP2、磷脂酶C流入、Ca2＋、DAG等，Gq型蛋白偶聯(lián)受體也在非經(jīng)典AR通路中有很重要的作用。為了確定哪個(gè)受體觸發(fā)了與AR轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的磷酸化反應(yīng)。張?jiān)觯?9］使用一種特異性的AR阻斷劑——氟他胺，使支持細(xì)胞中的AR失去作用，同時(shí)終止了細(xì)胞核膜之間的AR運(yùn)輸，結(jié)果表明，雄激素通過經(jīng)典AR誘導(dǎo)的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)參與了AR轉(zhuǎn)運(yùn)。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞質(zhì)與AR中的Src激酶處于一種相對平穩(wěn)的狀態(tài)。A.T.Szafran等［30］在研究中發(fā)現(xiàn)，在睪酮刺激后的很短時(shí)間內(nèi)Src激酶發(fā)生磷酸化，而AR在細(xì)胞核的定位和分布的減少是靠抑制Src激酶的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。這證明抑制Erk1／2磷酸化后，膜內(nèi)AR的轉(zhuǎn)運(yùn)沒有變化；而在MEK或Akt磷酸化被抑制后，AR在細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間的轉(zhuǎn)運(yùn)被阻斷，同時(shí)MEK或Akt磷酸化也影響了AR自身的運(yùn)輸。張?jiān)觯?9］的研究表明，Src激酶活性的減少可能是依靠抑制MEK或者Akt的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的，微量的Src激酶抑制劑MPP1就可以完全抑制Src激酶活性，使得細(xì)胞核與細(xì)胞膜之間的AR轉(zhuǎn)運(yùn)受到有害的影響。這與MEK或Akt的受阻磷酸化沒有區(qū)別。通過激活MEK和AKT激酶可以激活Src激酶，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)AR從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核及細(xì)胞膜間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的過程。

6 結(jié)論

隨著社會經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)的變化，養(yǎng)殖業(yè)呈現(xiàn)發(fā)展不均衡現(xiàn)象，很多經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的養(yǎng)殖環(huán)境差，影響公畜精液品質(zhì)。如何提高公畜的繁殖力及生產(chǎn)效率，進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)收入已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的主題。為了保證雄激素正常分泌和發(fā)揮作用，需要公畜保持性欲，產(chǎn)生健康、足量精子；而支持細(xì)胞AR缺失、功能損害和缺少雄激素都會影響公畜的繁殖能力。支持細(xì)胞中AR參與了多個(gè)精子發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期，例如血睪屏障的分解和重建都對生精過程產(chǎn)生重大的影響。而且人們對AR（特別是支持細(xì)胞中AR非經(jīng)典途徑）作用機(jī)制的了解還不夠多，另有許多細(xì)節(jié)值得切磋探討。