毛水蘇組織培養(yǎng)技術(shù)研究

金 瓊， 劉 悅， 劉德江， 申 健

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007； 2.牡丹江市第十五中學(xué)， 黑龍江 牡丹江 157000)

毛水蘇(StachysbaicalensisFisch.ex Benth.)為唇形科水蘇屬多年生草本植物，別名水蘇草、野紫蘇、山升麻等，是國家重點(diǎn)保護(hù)兼蜜源植物。毛水蘇分布在我國黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙、山東、山西、陜西等地，多呈零星分布[1]。毛水蘇作為一種中藥，全草及根入藥，具有祛風(fēng)解毒，止血之功效。此外，毛水蘇花期長，流蜜量大，蜜色潔白透明，氣味純正芳香，低溫不易凝稠結(jié)晶，其質(zhì)量僅次于椴樹蜜，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值高有發(fā)展前景的蜜源植物[2]。

毛水蘇喜濕潤肥沃土壤，天然多分布在濕地雜草稀疏的隙地和河床邊緣的河灘地，曾經(jīng)是遍布三江平原的典型地域性植物[1]。然而經(jīng)過多年的圍墾造田，截流改河道，盲目開發(fā)濕地等，毛水蘇近30年來大面積消失，瀕臨滅絕。在對(duì)破壞生態(tài)為代價(jià)發(fā)展經(jīng)濟(jì)的反思后，生態(tài)文明建設(shè)納入國家總體戰(zhàn)略布局。國家對(duì)三江濕地珍貴瀕危植物的恢復(fù)非常重視，2016年已批復(fù)在三江濕地核心區(qū)——大佳河濕地試驗(yàn)區(qū)投入1 000余萬元恢復(fù)毛水蘇[3]?？梢灶A(yù)見，毛水蘇的恢復(fù)與發(fā)展不但可再現(xiàn)往年濕地盛景，在一定程度上也為東北黑蜂種群的存續(xù)繁衍提供雄厚的物質(zhì)基礎(chǔ)。

毛水蘇根蘗和種子均可繁殖，但具有種子不便采收，根蘗繁殖數(shù)量有限等缺點(diǎn)。采用植物組織培養(yǎng)方法繁殖幼苗，可以縮短繁殖周期，擴(kuò)大繁殖數(shù)量[4]，加大其植株儲(chǔ)備量。本試驗(yàn)的目的是篩選出適合毛水蘇快速繁殖的組織培養(yǎng)技術(shù)，為濕地植被恢復(fù)及毛水蘇的開發(fā)利用提供材料及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為野生毛水蘇植株，取材于饒河縣大佳河濕地。選取長勢(shì)粗壯，無病蟲害的植株莖段作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體消毒處理

挑選長勢(shì)一致的植株，剪去葉片，保留葉柄基部，用軟毛刷加洗潔精刷洗1次，然后用自來水流水沖洗1 h，75%乙醇浸泡30 s后用無菌水沖洗3～4次[5]。最后用0.1%HgCl2溶液加5滴吐溫80浸泡5 min，無菌水沖洗3～4次后備用。

1.2.2基本培養(yǎng)基的篩選

在WPM，MS，1/2 WPM，1/2 MS 4種培養(yǎng)基上分別接入莖段外植體，每種培養(yǎng)基接10瓶，每瓶接5個(gè)外植體，觀察莖段腋芽生長情況，20 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率和芽長，篩選出適宜基本培養(yǎng)基。

萌芽率(%)=(萌芽數(shù)/外植體的總數(shù))×100%。

1.2.3不同植物激素對(duì)不定芽增殖的影響

在篩選出的基本培養(yǎng)基中分別加入6-BA(0.5，1.0，1.5 mg·L-1)，NAA(0.01，0.05，0.10 mg·L-1)，2,4-D(0.2，0.4，0.6 mg·L-1)及IBA(0.01，0.05，0.10 mg·L-1)，將腋芽接入培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接10瓶，每瓶接5個(gè)腋芽。20 d后統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)及芽長，篩選出較適宜的激素種類。然后進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究幾種激素組合作用效果，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

芽增殖系數(shù)=再生叢生芽總數(shù)/接種腋芽總數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

水平因 素6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)IBA/(mg·L-1)10.50.010.0121.00.050.0531.50.100.10

1.2.4最佳生根培養(yǎng)基篩選

將增殖獲得的叢生芽切成1.0 cm左右高的不定芽，接種于不同的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種5個(gè)不定芽，每個(gè)處理接種10瓶。選擇1/2 WPS為基本培養(yǎng)基，分別附加3個(gè)IBA濃度梯度0.05、0.10、0.15 mg·L-1，3個(gè)NAA濃度梯度0.10、0.20、0.30 mg·L-1，共6個(gè)處理。30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根數(shù)、根長、芽長以及生長情況等。

以上增殖培養(yǎng)基附加蔗糖30 g·L-1，生根培養(yǎng)基附加蔗糖20 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH調(diào)至6.0，121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為1 200～1 500 lx，光照時(shí)間12 h·d-1[6]。

1.2.5生根苗與不生根苗移栽比較

將生根良好的組培苗從培養(yǎng)室取出，置于室內(nèi)光照下煉苗3 d，打開瓶口2 d后進(jìn)行移栽。從瓶中小心取出小苗，用20 ℃左右溫水洗凈在根系上附著的培養(yǎng)基，然后迅速移栽入塑料穴盤中。移栽基質(zhì)為田園土∶粗沙∶腐殖土=1∶1∶1。移栽初期注意增大濕度并遮陰，移栽30 d后調(diào)查移栽成活率、株高及生長情況。將未經(jīng)過生根培養(yǎng)的苗同時(shí)進(jìn)行移栽，比較生根苗和不生根苗的生長差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

接種20 d后，觀察莖段腋芽生長情況，結(jié)果見表2。

4種基本培養(yǎng)基中的毛水蘇均可從葉腋處長出不定芽，由于培養(yǎng)基中未添加植物激素，所以沒有出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。由表2可知：WPM培養(yǎng)基的萌芽率最高，為188.00%，顯著高于其他3種培養(yǎng)基。WMP和MS培養(yǎng)基的芽長無顯著性差異，但顯著高于另外2種培養(yǎng)基。WPM培養(yǎng)基中芽長最大，為2.86 cm。從長勢(shì)上看，WPM培養(yǎng)基中的不定芽生長得較粗壯，顏色濃綠。1/2 WPM培養(yǎng)基中的不定芽顏色黃白，莖纖細(xì)。MS和1/2 MS培養(yǎng)基中的不定芽生長得纖細(xì)，顏色黃綠到黃白，且有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)。所以，選擇WPM培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)毛水蘇腋芽生長的影響

基本 培養(yǎng)基 萌芽率/%芽長/cm生長狀況 WPM188.00±4.00a2.86±0.15a顏色濃綠,莖粗壯MS156.67±4.23b2.78±0.21a顏色黃綠,莖纖細(xì),有玻璃化現(xiàn)象1/2WPM123.33±2.54c2.25±0.11b顏色黃白,莖纖細(xì)1/2MS118.00±2.05c2.07±0.08b顏色黃白,莖纖細(xì),有玻璃化現(xiàn)象

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2 不同植物激素對(duì)不定芽增殖的影響

在WPM培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的植物激素，將組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)出的腋芽接種于不同培養(yǎng)基中，不同植物激素對(duì)不定芽增殖的影響見表3。

表3 不同植物激素對(duì)毛水蘇腋芽增殖效果的影響

激素種類 濃度/(mg·L-1) 芽增殖系數(shù)芽長/cm6-BA0.502.16±0.13c3.45±0.21a6-BA1.003.76±0.19a3.38±0.19a6-BA1.502.68±0.17b3.42±0.22aNAA0.011.76±0.11d3.37±0.17aNAA0.051.28±0.09e3.31±0.14aNAA0.101.56±0.10de3.33±0.15a2.4-D0.200.00±0.00g0.00±0.00b2.4-D0.400.00±0.00g0.00±0.00b2.4-D0.600.00±0.00g0.00±0.00bIBA0.011.04±0.05ef3.40±0.22aIBA0.051.56±0.08de3.36±0.17aIBA0.101.10±0.05ef3.38±0.21a

培養(yǎng)中觀察到，添加激素2,4-D的培養(yǎng)基中不定芽全部死亡，其他3種激素培養(yǎng)基中有不同程度的增殖。添加6-BA的培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最大，顯著高于另外2種激素。添加6-BA的3個(gè)處理間增殖系數(shù)有顯著性差異，6-BA 1.00 mg·L-1的處理增殖系數(shù)最大，為3.76。從芽長看，3種激素各處理間差異不顯著。這說明所選激素對(duì)增殖系數(shù)產(chǎn)生了差異影響，對(duì)芽長沒有差異影響。

將6-BA、NAA和IBA 3種激素進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究其混合效果，結(jié)果見表4。

通過試驗(yàn)結(jié)果分析可知：A2為A因素的優(yōu)水平，B1為B因素的優(yōu)水平，C2為C因素的優(yōu)水平。3個(gè)因素的優(yōu)水平組合為A2B1C2，即毛水蘇不定芽增殖的最佳激素濃度組合為6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1，增殖系數(shù)為2.36。因?yàn)镽A>RC>RB，所以，3個(gè)因素對(duì)增殖系數(shù)的影響主次順序?yàn)锳、C、B，即6-BA最大，其次是IBA，而NAA最小。

表4 正交試驗(yàn)優(yōu)化增殖培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果

水平因 素6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)IBA/(mg·L-1)增殖系數(shù)11.001.001.001.6521.002.003.001.4831.003.002.001.7642.001.002.002.3652.002.001.002.0362.003.003.002.1173.001.003.001.8183.002.002.001.8493.003.001.001.76K11.631.941.81K22.171.781.99K31.801.881.80R0.540.160.19

注：K值為同一水平的平均值，R為極差。

圖1 毛水蘇增殖培養(yǎng)

2.3 最佳生根培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

將增殖培養(yǎng)出的叢生芽接種到生根培養(yǎng)基中，30 d后觀察生根情況，結(jié)果見表5。

培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，毛水蘇是極易生根植物，所選激素及濃度均可生根，生根率93.85%～100%，各處理間無顯著性差異。NAA 0.30 mg·L-1的處理生根數(shù)最多，平均4.17條，顯著高于其他處理。NAA 0.30 mg·L-1和0.20 mg·L-1處理根長最長，此2個(gè)處理根長差異不顯著，但顯著高于其他處理。NAA各處理間芽長無顯著性差異，但顯著高于IBA各處理的芽長。IBA各處理間芽長無顯著性差異。綜合考慮，NAA更適合在毛水蘇組培苗生根培養(yǎng)基中使用，使用濃度為0.30 mg·L-1。

表5 不同植物激素對(duì)毛水蘇生根效果的影響

激素濃度/(mg·L-1)生根率/% 生根數(shù)/條根長/cm芽長/cmIBA0.0594.36±1.65a1.74±0.11d 1.75±0.07c 3.35±0.21bIBA0.1096.51±1.27a2.56±0.21c 2.15±0.09b3.42±0.18bIBA0.1593.85±1.88a1.85±0.18d2.24±0.05b3.56±0.16bNAA0.1098.25±1.34a2.98±0.15b2.26±0.06b3.79±0.22aNAA0.20100.00±0.00a3.05±0.27b3.32±0.22a3.86±0.25aNAA0.30100.00±0.00a4.17±0.35a3.58±0.46a3.88±0.22a

圖2 毛水蘇生根培養(yǎng)

2.4 生根苗與不生根苗移栽比較

將組織培養(yǎng)中生根苗及未經(jīng)生根培養(yǎng)的苗同時(shí)移栽，30 d后觀察生長情況，結(jié)果見表6。

表6 生根苗與不生根苗栽培比較

成活率/%株高/cm生長狀況生根苗100.00±0.00a8.56±0.350a緩苗快,植株健壯,顏色濃綠不生根苗71.36±3.65b6.21±0.026b緩苗慢,植株健壯,顏色淡綠

由表6可知，毛水蘇是極易成活植物，生根苗移栽成活率100%，即使沒有經(jīng)過生根培養(yǎng)的苗，移栽后成活率也能達(dá)到71.36%。生根苗移栽后緩苗快，植株健壯，顏色濃綠，株高可達(dá)8.56 cm。不生根苗移栽后緩苗慢，顏色淡綠，株高6.21 cm。

3 討論與結(jié)論

WPM和MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一般木本植物多選擇WPM培養(yǎng)基[7]，草本植物多選擇MS培養(yǎng)基。本試驗(yàn)中，不添加任何植物激素條件下，WPM培養(yǎng)基更適合毛水蘇組織培養(yǎng)，萌芽率高，植株生長健壯，顏色濃綠，未出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，這說明WPM也不局限于木本植物使用。

單因素試驗(yàn)表明：6-BA對(duì)毛水蘇增殖培養(yǎng)效果最好。添加6-BA 1.00 mg·L-1的處理增殖系數(shù)最大，為3.76。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1對(duì)毛水蘇增殖培養(yǎng)效果最好，增殖系數(shù)為2.36。從增殖系數(shù)大小看，3種激素的組合不如單獨(dú)使用6-BA的效果好，但比單獨(dú)使用NAA或IBA效果好。所以，可選擇WPM+6-BA 1.00 mg·L-1作為毛水蘇的增殖培養(yǎng)基使用。正交試驗(yàn)表明，3個(gè)因素主次順序?yàn)?-BA最大，其次是IBA，而NAA最小。這與單因素試驗(yàn)中6-BA效果優(yōu)于其他兩種激素相吻合。

毛水蘇是極易生根植物，在試驗(yàn)所選激素及濃度條件下均可生根，生根率為93.85%～100%。綜合考慮生根率、生根數(shù)、根長和芽長等指標(biāo)，認(rèn)為毛水蘇組培苗生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+NAA 0.30 mg·L-1。鑒于毛水蘇易生根特性，試驗(yàn)中進(jìn)行了生根苗和不生根苗移栽比較，從移栽成活率看，生根苗成活率100%，不生根苗成活率71.36%。生根苗移栽緩苗期短，植株生長快，同期株高明顯高于不生根苗。但從生產(chǎn)周期和成本角度考慮，如果省略生根培養(yǎng)環(huán)節(jié)，可以縮短20～30 d的培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)節(jié)省培養(yǎng)中所需試劑、水、電、人工等各方面的成本。雖然不生根苗移栽成活率低于生根苗，但如果大量工廠化生產(chǎn)，從節(jié)省成本，創(chuàng)造更大經(jīng)濟(jì)效益角度考慮，可以省去生根培養(yǎng)環(huán)節(jié)，直接將增殖培養(yǎng)出的苗進(jìn)行移栽。