小鼠胚胎玻璃化冷凍方法的改進(jìn)研究

高 妍，郝金棟，袁 寶，姜 昊，陳承禎，張嘉保

（吉林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，長春 130062）

雖然胚胎玻璃化冷凍技術(shù)已趨于成熟和穩(wěn)定，但降低冷凍損傷、簡化操作步驟、提高冷凍效率仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。1970年，研究人員在深海魚的血清中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白［1］，這種蛋白能通過非共價吸附到冰核表面，抑制冰晶生成和重結(jié)晶，減少機(jī)體因結(jié)冰引起的損害［2］?？箖龅鞍滓呀?jīng)廣泛應(yīng)用到食品加工［3］、農(nóng)作物抗凍［4］、胚胎以及精液冷凍［5］中，并取得了良好的抗凍效果?？箖龅鞍注螅ˋFPⅢ）是一種主要存在于綿尉亞科魚類的球蛋白，其親水殘基的氫鍵與冰晶有較好的結(jié)合力，可以減少降溫過程中冰晶的生成而起到冷凍保護(hù)作用。試驗(yàn)將AFPⅢ應(yīng)用于小鼠囊胚玻璃化冷凍，并采用兩步、三步解凍法解凍，觀察冷凍效果，為改良玻璃化冷凍方法、提高冷凍效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

SPF級雌性ICR小鼠30只、雄性ICR小鼠10只，飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［SCXK（吉）2016－0001］。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25℃，相對濕度為50%～60%，每日光照12 h。試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照動物使用指南進(jìn)行并給予試驗(yàn)動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器、用品

AFPⅢ，購自A／F Protein Inc公司；胎牛血清（FBS），購自Gibco公司；孕馬血清（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG），購自寧波第二激素廠；蔗糖、聚蔗糖、乙二醇（EG）、二甲基亞砜（DMSO）、M16培養(yǎng)液、M2操作液，均購自Sigma公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，購自Thermo Fisher公司；小鼠取卵手術(shù)器械，購自上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠；胚胎冷凍管，購自青島益然生物科技有限公司；液氮罐，購自河南天馳儀器設(shè)備有限公司。以上儀器及設(shè)備由吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院模式動物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)步驟及方法

1.3.1 小鼠胚胎的獲取與培養(yǎng) 取10只7周齡的ICR雌鼠，腹腔注射10 IU PMSG，48 h后注射10 IU hCG，與雄鼠合籠過夜。次日早晨檢查陰道栓，將有陰道栓的雌鼠取出單獨(dú)飼養(yǎng)，注射hCG，48 h后頸椎脫臼處死。用滅菌的手術(shù)器械取出雌鼠輸卵管，用1 mL注射器劃破，用口吸管收集2細(xì)胞期胚胎，轉(zhuǎn)移至提前平衡的M16培養(yǎng)液滴中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)育至囊胚期，用于冷凍試驗(yàn)。

1.3.2 玻璃化冷凍液和解凍液的配制 基礎(chǔ)液（FS）：10%胎牛血清（FBS）＋90%杜氏磷酸鹽緩沖液（dPBS）＋30%聚蔗糖 ＋0.5 mol／L蔗糖。預(yù)平衡液：10% EG＋10% DMSO。玻璃化冷凍液：EFS30為70% FS＋30% EG，EFS40為60% FS＋40% EG；EFSA30為EFS30＋500 ng／mL AFPⅢ，EFSA40為EFS40＋500 ng／mL AFPⅢ。解凍液1：含0.5 mol／L蔗糖的M2操作液；解凍液2：含0.25 mol／L蔗糖的M2操作液。

1.3.3 胚胎玻璃化冷凍 將囊胚分為4組，分別以EFS30、EFS40、EFSA30和EFSA40為冷凍液對小鼠囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍。具體方法：將準(zhǔn)備好的囊胚用預(yù)平衡液處理5 min后，再用冷凍液處理1 min，然后按照圖1步驟將胚胎裝入0.25 mL細(xì)管中，直接投入液氮中保存。將冷凍后的胚胎用兩步法進(jìn)行解凍，統(tǒng)計(jì)每組胚胎解凍后的存活數(shù)和孵化數(shù)，計(jì)算存活率和孵化率。

1.3.4 胚胎的解凍及培養(yǎng) 用冷凍效果較好的冷凍液對胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍，然后將冷凍的胚胎分為2組，分別用兩步法和三步法解凍。具體方法：將冷凍細(xì)管從液氮中取出，放入37℃水浴。待管中溶液溶解后剪掉封口端，推動棉栓使管中內(nèi)容物流入解凍液中，在體視顯微鏡下回收胚胎。兩步法是將回收的胚胎先移入解凍液1中復(fù)蘇5 min，再移入新鮮的M16培養(yǎng)液復(fù)蘇5 min；三步法是將回收的胚胎先移入解凍液1中復(fù)蘇3 min，再移入解凍液2中復(fù)蘇3 min，最后移入新鮮的M16培養(yǎng)液復(fù)蘇3 min。解凍后的胚胎移入平衡好的M16培養(yǎng)液滴中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)每組胚胎解凍后的存活數(shù)和孵化數(shù)，計(jì)算存活率和孵化率。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFPⅢ對胚胎玻璃化冷凍效果的影響

結(jié)果見表1。

表1 小鼠囊胚玻璃化冷凍存活率和孵化率測定結(jié)果

由表1可以看出：EFSA30組存活率和孵化率分別為83.7%和75.2%，顯著高于EFS30組（P＜0.05）；EFSA40組存活率和孵化率分別為56.3%和64.4%，顯著高于EFS40組（P＜0.05）；EFSA30組存活率和孵化率顯著高于EFSA40組（P＜0.05）。說明AFPⅢ可以提高冷凍胚胎的存活率和孵化率。由于冷凍液EFSA30的效果好于EFSA40，遂選用EFSA30進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 不同解凍方法對胚胎冷凍效果的影響

結(jié)果見表2。

表2 兩種方法解凍后小鼠囊胚玻璃化冷凍存活率和孵化率測定結(jié)果

由表2可以看出，用三步法解凍后，囊胚存活率和孵化率分別為92.8%和83.3%，顯著高于兩步法（P＜0.05）。說明用冷凍液EFSA30對囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍后，用三步法解凍可以獲得更多存活的胚胎。

3 討論

3.1 AFPⅢ對胚胎玻璃化冷凍效果的影響

自玻璃化冷凍胚胎技術(shù)成功以來，人們一直為改進(jìn)冷凍方法和冷凍液的配方做著不斷的研究［6－8］。EFS30和EFS40冷凍液是在基礎(chǔ)冷凍液中添加聚蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于小鼠胚胎的玻璃化冷凍中。傳統(tǒng)的冷凍保護(hù)劑主要是一些人工合成的化學(xué)物品，而抗凍蛋白是存在于自然界中具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)，它的發(fā)現(xiàn)為冷凍液的改良提供了新的思路。抗凍蛋白生物來源主要有魚類［9］、植物類［10］、昆蟲類［11］和微生物類［12］四種，其中魚類抗凍蛋白由于發(fā)現(xiàn)較早，研究相對較多。AFPⅢ是魚類抗凍蛋白中的一種，已經(jīng)被證明可以應(yīng)用于胚胎冷凍［13］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在傳統(tǒng)冷凍液中添加AFPⅢ后，EFSA30組冷凍囊胚解凍后的存活率和孵化率為83.7%和75.2%，顯著高于EFS30組（67.9%和61.3%）。EFSA40組冷凍囊胚解凍后的存活率和孵化率為56.3%和64.4%，顯著高于EFS40組（51.7%和45.5%）。因此，AFPⅢ可以作為一種良好的保護(hù)劑用以提高胚胎玻璃化冷凍效率。

3.2 解凍方法對胚胎玻璃化冷凍效果的影響

在以往研究中發(fā)現(xiàn)，采用一步冷凍法，胚胎瞬間進(jìn)入高滲的冷凍液，急劇脫水會對胚胎結(jié)構(gòu)造成損害，因此兩步冷凍法比一步冷凍法的冷凍效果好［14－15］。而在解凍方面卻存在不同觀點(diǎn)，不同實(shí)驗(yàn)室對兩步法和三步法解凍各有偏好。此外，胚胎玻璃化冷凍效果還與冷凍時胚胎所處發(fā)育階段有關(guān)，不同發(fā)育時期的胚胎應(yīng)該選用適合該階段的冷凍配方和方法［16－18］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在EFS30中添加AFPⅢ后，用三步法解凍玻璃化冷凍的囊胚存活率和孵化率顯著高于兩步法。這可能與三步法中多梯度溶液的緩沖作用有關(guān)。然而三步法是否適用于其他發(fā)育階段的胚胎冷凍，還需要進(jìn)一步研究探索。

4 結(jié)論

在冷凍液中添加AFPⅢ可以有效提高小鼠囊胚的玻璃化冷凍效果。此外，相對于兩步解凍法，三步解凍法更適合于囊胚階段胚胎玻璃化冷凍后的解凍過程，這為胚胎玻璃化冷凍方法的改進(jìn)提供了新的思路和參考依據(jù)。