S100P在NSCLC中的表達(dá)、信號通路和預(yù)后關(guān)系生物信息分析及驗證

湯山松 劉娟

1資陽市人民醫(yī)院腫瘤科641300;2四川省人民醫(yī)院病理科,成都610000

肺癌是臨床上最為常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率在男性為第一位,女性為第二位,且病死率位居所有腫瘤的第一位[1]。一直以來,肺癌都是影響人類生存健康的重大難題之一。近期發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計報告顯示,肺癌、氣管和支氣管腫瘤發(fā)病率及病死率居各種癌癥之首位[2]。因此,找出特異度、敏感度更高的蛋白及基因標(biāo)志物,對于肺癌的早期診治及評估預(yù)后具有重要價值。

近些年的研究表明S100P 在人類多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá),并與患者腫瘤病理學(xué)特征存在一定的關(guān)系[3]。然而S100P 在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)情況及其與NSCLC 患者生存關(guān)系研究鮮有報道。本研究采用生物信息學(xué)方法分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中S100P的表達(dá)水平及其高低表達(dá)與NSCLC 患者總生存期 (overall survival,OS)和無疾病進(jìn)展生存期 (disease free survival,DFS)的關(guān)系。同時,采用免疫組織化學(xué)法檢測48例NSCLC患者腫瘤組織中S100P 蛋白表達(dá)水平,并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系,對前述生物信息分析結(jié)果進(jìn)行驗證。

1 對象與方法

1.1 S100P表達(dá)水平分析 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中分析“肺癌”“非小細(xì)胞肺癌” “鱗癌” “腺癌”和“S100P基因”檢索物種為人類,分析S100P 基因在多種組織中的變動情況,并比較其在腫瘤組織和對應(yīng)的癌旁正常組織中的差異表達(dá)情況。認(rèn)為存在組織差異表達(dá)的條件為S100P基因m RNA 上調(diào)或下調(diào)表達(dá)超過2 倍 (|Log2FC|＞1),且P＜0.05[4]。

1.2 S100P 蛋白網(wǎng)絡(luò)分析 采用STRING 數(shù)據(jù)庫,與S100P相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò),并分析其相關(guān)蛋白聚類情況,S100P 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.5,相互作用來源為共表達(dá)、基因功能和比鄰關(guān)系[5]。

1.3 共表達(dá)及生存分析 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中,依據(jù)與S100P基因共表達(dá)關(guān)系,選取正相關(guān)和負(fù)相關(guān)表達(dá)最為明顯的2個基因進(jìn)行分析,計算相關(guān)系數(shù);根據(jù)S100P基因在NSCLC患者癌組織中表達(dá)的中位數(shù),分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,采用Logrank檢驗分析比較S100P 基因表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測S100P蛋白表達(dá) 回顧性分析四川省資陽市人民醫(yī)院收治的NSCLC患者48例,采用免疫組織化學(xué)法檢測患者手術(shù)標(biāo)本中NSCLC患者癌組織和癌旁正常組織中S100P蛋白表達(dá)水平,分析比較S100P 基因編碼蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。免疫組織化學(xué)檢測S100P 蛋白表達(dá)按試劑盒操作說明進(jìn)行。S100P蛋白表達(dá)高低表達(dá)判定,在高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野,根據(jù)著色強(qiáng)弱和陽性細(xì)胞比例綜合判定S100P 表達(dá)強(qiáng)度。按色強(qiáng)度評分：不著色 (0分)、淺黃 (1分)、棕黃(2分)、棕褐色(3分);按照每高倍鏡 (SP×200)下陽性細(xì)胞所占的比例分為＜10% (0分)、≥10%且＜25% (1分);≥25%且＜50% (2分)、≥51%且＜75% (3分);≥75% (4分)?？傮w評分值=陽性細(xì)胞比例評分×染色強(qiáng)度評分。最終評判：＜6分為低表達(dá),≥6分為高表達(dá)。低表達(dá)率(%)=低表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。高表達(dá)率(%)=高表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析SAS 9.1統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)分析,計量資料以x-±s表示,數(shù)據(jù)比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)表示,數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗。S100P基因高低表達(dá)組生存期采用Logrank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100P 基因表達(dá) TCGA 數(shù)據(jù)庫中,S100P蛋白在大多數(shù)腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá);在肺腺癌組織中S100P 基因表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P＜0.05)。同時,S100P表達(dá)水平在NSCLC不同臨床分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=3.74,P＜0.05)。見圖1、2。

圖1 S100P基因mRNA 在肺腺癌、肺鱗癌及對應(yīng)正常組織中的表達(dá) A：肺腺癌與對應(yīng)正常組織;B：肺鱗癌與對應(yīng)正常組織

圖2 S100P基因m RNA 表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床分期的關(guān)系

2.2 S100P 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 蛋白-蛋白相互作用關(guān)系采用String數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,選取了與S100P 蛋白相互作用較為緊密的蛋白網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)50個,相互作用關(guān)系236個,區(qū)域聚類指數(shù)為0.39,蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)富集顯著 (P＜0.05)。

2.3 相關(guān)分析 共表達(dá)分析顯示,與S100P基因正相關(guān)表達(dá)最顯著的基因為FURIN 基因 (r=0.55,P＜0.05),與S100P 基因負(fù)相關(guān)表達(dá)最顯著的基因為CAMK1 (r=-0.38,P＜0.05)。

2.4 生存分析 生存分析顯示高表達(dá)組與低表達(dá)組OS 差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (HR=1.1,P＞0.05),高表達(dá)組患者DFS低于低表達(dá)組(HR=1.3,P＜0.05),見圖3、4。肺腺癌中S100P高表達(dá)患者OS 和DFS 生存均低于低表達(dá)組 (P值均＜0.05)。

圖3 S100P基因m RNA 在非小細(xì)胞肺癌患者中總生存期的受試者工作特征曲線

圖4 S100P基因m RNA 在非小細(xì)胞肺癌患者中無疾病進(jìn)展生存期的受試者工作特征曲線

2.5 S100P基因編碼蛋白表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)顯示S100P 蛋白主要表達(dá)于肺癌或正常肺組織細(xì)胞核,呈現(xiàn)棕褐色顆粒 (圖5)。S100P 在NSCLC患者癌和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為54.2% (26/48)和16.7% (8/48),癌組織中陽性標(biāo)的率顯著高于癌旁組織 (χ2=14.76,P＜0.05)。

2.6 S100P 蛋白表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征關(guān)系 S100P 蛋白在癌組織中的陽性表達(dá)與NSCLC患者的臨床分期和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P值均＜0.05),而與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、病例分級和有無胸水無關(guān) (P值均＞0.05),見表1。

3 討論

S100P是介導(dǎo)鈣離子結(jié)合蛋白S100家族重要成員[6-7]。自1992 年S100P 被報道以來,這種相對分子質(zhì)量10 400的鈣結(jié)合蛋白就受到了研究這的廣泛的關(guān)注。雖然S100P 自身在人體組織中并非廣泛表達(dá),但人體胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8-10]。

S100P在進(jìn)化方面也相對較新,因為它只存在于脊椎動物的基因組中。在子宮壁激素節(jié)律性波動過程中觀察到這種蛋白的表達(dá),它可能與胚胎著床以及發(fā)育中的胚胎有密切關(guān)系。然而,大多數(shù)已發(fā)表的研究認(rèn)為S100P在多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在人類惡性腫瘤中,S100P越來越被認(rèn)為是一種潛在的診斷和治療靶點。

相關(guān)研究顯示,S100P在多種不同類型的腫瘤中大多呈現(xiàn)高水平表達(dá)[11],這與我們生物信息分析結(jié)果也較為一致。此外,大量來自轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)顯示S100P 在體外和體內(nèi)過度表達(dá),腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)生明顯改變,包括增殖、遷移能力等。S100P的表達(dá)受多種激素的影響,并受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。相關(guān)實驗證實S100P在雄激素[12]、smad、stat/creb和sp/klf[13]以及孕酮[14]等因子作用下明顯上調(diào)。在體外研究中,BMP4 也被確定為S100P 表達(dá)的調(diào)節(jié)因子,在這兩種蛋白質(zhì)之間觀察到正相關(guān)表達(dá)[15]。同時,在轉(zhuǎn)移性和雄激素難治性前列腺癌細(xì)胞中觀察到IL-6和S100P表達(dá)之間的相關(guān)性,并推測IL-6可刺激S100P表達(dá)[16]。

表1 S100P基因編碼蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征關(guān)系 [例 (%)]

S100P在NSCLC中的表達(dá)研究報道不多,其在NSCLC中的表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系研究鮮有報道。根據(jù)S100P 在其他腫瘤中的表達(dá)情況及生物學(xué)功能,我們推測S100P在NSCLC的預(yù)后和臨床病理特征中也可能發(fā)揮重要作用。因此,我們分別采用生物信息和免疫組織化學(xué)方法探討S100P的表達(dá)情況及其與NSCLC 的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn),S100P在NSCLC患者,尤其是肺腺癌患者癌組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào),并與患者預(yù)后相關(guān)。S100P高表達(dá)患者OS 和DFS 明顯降低,提示S100P 可能是NSCLC 預(yù)后不良的危險因素。同時,免疫組織化學(xué)檢測也證實S100P 高表達(dá)患者分期較晚,縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高。也證實了其作為NSCLC預(yù)后不良的危險因素。

因此,S100P基因在NSCLC 患者腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá),并與NSCLC患者預(yù)后不良有關(guān),有望成為NSCLC患者預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)志物,并成為NSCLC靶向治療的潛在靶點。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突