攜hVEGF165表達(dá)載體陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡的制備

伍巧玲，丁云川，冉海濤，王志剛，陳 劍，王慶慧，張 鍵

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)；2.昆明市延安醫(yī)院 超聲醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650051；3.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所 重慶 400010）

目前基因治療用于臨床實(shí)驗(yàn)研究越來(lái)越多，而輸送基因入體內(nèi)的方法較多，但都存在一定的缺陷，如在輸送途中基因被降解，基因不穩(wěn)定，輸送載體可能會(huì)引起免疫反應(yīng)等。將超聲造影技術(shù)與基因治療結(jié)合起來(lái)，能顯著提升基因的轉(zhuǎn)染效率[1]，充分發(fā)揮治療疾病的作用。超聲造影劑可作為一種安全有效的基因載體，靶向精準(zhǔn)治療，延長(zhǎng)了造影劑在病區(qū)滯留時(shí)間，特異性增強(qiáng)了顯影效果，在診斷疾病的同時(shí)，又能擊破造影劑精準(zhǔn)釋放基因，促使基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。

陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡造影劑通過(guò)電荷孵育法與帶負(fù)電荷的基因相連輸入體內(nèi)，實(shí)時(shí)觀察造影劑的顯影途徑，使用低強(qiáng)度聚焦超聲技術(shù)靶向輻照擊破微泡，釋放基因，并促使其轉(zhuǎn)染，較高的提高了基因轉(zhuǎn)染效率[2-4]。

資料與方法

一、藥品和試劑 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、氨基甲?；懝檀迹仓；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000，全氟丙烷氣體，PBS緩沖液，甘油。

二、儀器 Malvern激光粒徑、電位測(cè)量?jī)x；銀汞膠囊調(diào)合器；投射式電子顯微鏡；光學(xué)顯微鏡、倒置熒光顯微鏡；紫外線分光光度計(jì)；電子天平；微量加樣槍；血球計(jì)數(shù)板。

三、實(shí)驗(yàn)方法 1.陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡的制備：將一定比例的二棕櫚酰磷脂酰膽堿、氨基甲?；懝檀?、二硬脂?；字Ｒ掖及? 聚乙二醇2000、甘油、PBS、三氯甲烷、全氟丙烷等經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、機(jī)械振蕩，制備出陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡。

2.測(cè)定陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡的理化特性：光鏡和電鏡下分別觀察微泡形態(tài)、濃度及分布；使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定其濃度；使用Malvern激光粒徑、電位測(cè)量?jī)x測(cè)定其粒徑大小、Zeta電位。

3.測(cè)定陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡與hVEGF165表達(dá)載體的結(jié)合率：將一定同濃度的微泡與不同量的hVEGF165表達(dá)載體通過(guò)電荷孵育法結(jié)合，待微泡出現(xiàn)分層后，上層為微泡與基因結(jié)合層，下層為未與微泡結(jié)合的游離基因液體，取下層清亮液體，用紫外線分光光度計(jì)測(cè)量游離的基因濃度，將基因總量減去剩余游離的基因量，除以基因總量，所得微泡結(jié)合基因的結(jié)合率。

分別將微泡使用Dio 染色成綠色熒光，hVEGF165表達(dá)載體使用Gel染色成紅色熒光。使用電荷孵育法，將微泡與hVEGF165表達(dá)載體結(jié)合，在倒置熒光顯微鏡下觀察兩者的結(jié)合情況。

結(jié)果

一、制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡 肉眼觀察：微泡呈現(xiàn)乳白色的混懸液，見(jiàn)圖1。400倍光學(xué)顯微鏡觀察：微泡呈圓球形，大小形態(tài)相對(duì)均一，分散情況良好，無(wú)明顯聚集現(xiàn)象，見(jiàn)圖2。透射電子顯微鏡放大不同倍數(shù)觀察：較清晰顯示外層包裹的磷脂材料薄膜以及內(nèi)部的全氟丙烷，表面尚光滑，見(jiàn)圖3。

二、微泡粒徑、電荷及濃度 微泡制備后1h，1d，7d，2W和4W，分別用馬爾文納米粒度Zeta 分析儀檢測(cè)平均粒徑和表面電位，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)濃度，見(jiàn)表1，圖4、5。

三、微泡與基因結(jié)合率 將染色后的微泡與質(zhì)粒連接后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，綠色激發(fā)光激發(fā)后，可見(jiàn)微泡呈現(xiàn)綠色熒光，紅色激發(fā)光激發(fā)后，在微泡表面呈紅色熒光包繞，表明染有紅色熒光的質(zhì)粒與染有綠色熒光的微泡連接成功，見(jiàn)圖6、7。

四、紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果 將不同基因量與一定的同濃度微泡通過(guò)電荷孵育法連接，微泡隨著基因量的增加，基因連接率增加，在基因?yàn)?0μg 時(shí)，結(jié)合率為（35.34±0.71）%，結(jié)合率達(dá)到最高，之后隨著基因量的增加，結(jié)合率出現(xiàn)降低，見(jiàn)表2。

討論

脂質(zhì)體曾經(jīng)一直是攜帶基因治療載體的研究熱點(diǎn)，由于脂質(zhì)體的成分與細(xì)胞的脂質(zhì)成分相同，所以有較高的生物相容性，利于細(xì)胞的內(nèi)吞，所攜帶的基因容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染?；驇ж?fù)電荷，則陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因載體隨之被研究，其表面所攜帶的正電荷與帶負(fù)電荷的基因，通過(guò)電荷孵育法而吸附到一起，從而有一定的攜帶基因能力[5,6]。陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡造影劑是脂質(zhì)體的一種特殊類(lèi)型，聯(lián)合超聲造影劑的優(yōu)點(diǎn)，在超聲技術(shù)條件下，觀察造影劑的顯影途徑，造影劑聚集在靶器官區(qū)域時(shí)，使用低強(qiáng)度聚焦超聲技術(shù)靶向輻照擊破陽(yáng)離子微泡，釋放基因，利用超聲波輻照所產(chǎn)生的空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)，使得基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核而發(fā)生轉(zhuǎn)染，較高的提高了基因轉(zhuǎn)染效率[4]。

本實(shí)驗(yàn)使用機(jī)械振蕩法制備出以陽(yáng)離子膽固醇為核心的陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡，平均粒徑：（1.31±0.23）μm，表面電荷：（28.00±1.84）mV，濃度：（3.17±0.16）×108，微泡的粒徑大小合適，濃度及Zeta電位相對(duì)較穩(wěn)定。電子顯微鏡投射及光鏡下觀察兩種脂質(zhì)微泡形態(tài)穩(wěn)定，大小均一，分布均勻。使用電荷孵育法與攜帶表達(dá)hVEGF165的質(zhì)粒相結(jié)合，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察微泡與基因結(jié)合情況，使用紫外線分光光度計(jì)計(jì)算基因與微泡的結(jié)合率。倒置熒光顯微鏡從定性角度檢測(cè)微泡是否與基因連接成功，而紫外線分光光度計(jì)從定量角度測(cè)量的微泡基因攜帶率，陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡最大結(jié)合率約（35.34±0.71）%，與普通脂質(zhì)微泡相比，陽(yáng)離子微泡具有較高的攜帶基因的能力，以上結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道相似[7,8]。張清鳳等[9]使用脂質(zhì)材料通過(guò)薄膜水化法，制作出了陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡，最高的載基因率為39.7%。傳統(tǒng)普通脂質(zhì)微泡攜帶基因量低，轉(zhuǎn)染率不高，但由于基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中無(wú)毒和無(wú)毒副作用，聯(lián)合超聲技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)靶向區(qū)域轉(zhuǎn)染基因的特點(diǎn)，曾受到廣大學(xué)著的關(guān)注，提高其基因攜帶能力也一直是研究熱點(diǎn)。隨著陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡的產(chǎn)生，普通脂質(zhì)微泡攜帶基因能力低的問(wèn)題得到了解決，多篇文獻(xiàn)報(bào)道，陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡造影劑攜帶基因的轉(zhuǎn)染率有了大幅度的提高，是普通微泡造影劑的20倍[10]，陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡造影劑攜帶基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染有較突出的優(yōu)勢(shì)。

表1 微泡平均粒徑、表面電荷及平均濃度（±s）

表1 微泡平均粒徑、表面電荷及平均濃度（±s）

注：h為小時(shí)，d為天，W為周，不同時(shí)間檢測(cè)各值間的比較。

組別濃度（108 個(gè)/mL）7d 3.03±0.15 Zeta 電位（mV）28.00±1.84 25.20±1.71 18.38±0.76平均粒徑（μm）1.31±0.23 1.47±0.58 1.45±0.21 1h 3.17±0.16 1d 3.06±0.17 2W 2.94±0.16 13.86±1.27 1.55±0.20 4W 1.76±0.20 9.68±0.56 1.68±0.19

表2 微泡與不同基因濃度時(shí)基因結(jié)合率%比較（±s）

表2 微泡與不同基因濃度時(shí)基因結(jié)合率%比較（±s）

注：微泡制作后，2h內(nèi)完成測(cè)量各數(shù)據(jù)。

基因量（μ）20 40 60結(jié)合率（%）17.12±.30 35.34±.71 28.42±1.07 80 29.00±1.70

圖1 微泡實(shí)物圖

圖2 微泡光鏡圖

圖3 微泡電鏡圖

圖4 微泡平均粒徑

圖5 表面電位

圖6 綠色熒光示微泡

圖7 紅色熒光示質(zhì)粒附著微泡

本實(shí)驗(yàn)存在不足之處，所制備出的微泡未能制作成干粉狀態(tài)，只能以液體形式存在，長(zhǎng)期保存可能會(huì)影響微泡粒徑大小、濃度及Zeta電位。另外所制備的攜hVEGF165表達(dá)載體陽(yáng)離子脂質(zhì)微泡未能進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其轉(zhuǎn)染率需進(jìn)一步驗(yàn)證。